李青　譚紅　袁鑫　何錦林　魏赫楠　李占彬

摘要：應(yīng)用高效液相色譜原理建立核桃青皮中胡桃醌活性成分的分析測定方法，該方法的線性回歸方程為y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），線性范圍為10～150 μg/mL，該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，回收率為 93.90%～95.14%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；胡桃醌；核桃；青皮

中圖分類號：O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0259-02

收稿日期：2013-06-05

基金項目：貴州省林業(yè)科研技術(shù)基金（編號：黔林科合J字[2012]18號）；國家國際科技合作專項（編號：2011DFB41640）。

作者簡介：李青（1987—），男，湖南益陽人，碩士，主要從事儀器分析方法的開發(fā)研究。E-mail：287476045@qq.com。胡桃醌是核桃青皮中的有效成分，具有抗腫瘤、抑菌及抗病毒、抗氧化等活性，目前已被應(yīng)用于醫(yī)藥方面的研究[1]。高效液相色譜的分離原理與其他色譜法相同，都是利用混合物中各組分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而被分別分離的原理[2]。現(xiàn)在使用的微處理機控制的高效液相色譜儀，其自動化程度非常高，不僅能控制儀器的相關(guān)操作參數(shù)（如溶劑的梯度洗脫、流動相流量與流速、柱溫、自動進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測器功能等），而且還能對獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加，并對保留時間和峰高、峰面積進(jìn)行綜合處理，使色譜分析工作者能高效率、高質(zhì)量、高標(biāo)準(zhǔn)地完成分析工作[3]，因此它在天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的研究及植物藥的發(fā)展中起著非常重要的作用。天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)不像化學(xué)藥品那樣簡單、規(guī)范、物質(zhì)單一，它們不僅有著非常復(fù)雜的成分，而且各種成分之間可能會相互影響和相互作用。因此，根據(jù)不同的分析對象、目的以及要求，可以利用高效液相色譜技術(shù)對天然產(chǎn)物某一成分化合物建立高效、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法或定量方法。本試驗就是利用高效液相色譜技術(shù)，建立了一種對胡桃醌含量的高效、快速的HPLC檢測方法。

1材料與方法

1.1材料

核桃主要由貴州省赫章縣提供。

97%胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）、磷酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氯仿、氫氧化鈉均為分析純，甲醇為色譜純。

Agilent1100高效液相色譜儀，PHS-3C型精密pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），XS-20B粉碎機（上海兆申電子科技有限公司），ALC-110.4電子天平（北京賽多利科學(xué)儀器有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），H-1850R型高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司），SC-316冰箱（山東省青島海爾股份有限公司），78-1型磁力攪拌器（江蘇省常州澳華儀器有限公司），KQ-50型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1色譜條件色譜柱選用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相采用甲醇-水（體積比1 ∶1），水相先用磷酸調(diào)節(jié)pH值約為4，流速為0.8 mL/min，紫外檢測波長為 250 nm，柱溫為 30 ℃。

1.2.2胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精確稱取胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品 5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解（在超聲波清洗器上振蕩5 min后）在室溫下冷卻后再用甲醇定容，搖勻，即得200 μg/mL胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液須放在冰箱中保存，防止甲醇揮發(fā)和長時間放置在陽光下使標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)分解，給試驗帶來誤差。

1.2.3最大吸收波長的測定和選擇對胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液在220～400 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，選定檢測波長。

1.2.4流動相組成的確定以甲醇-水體系作為流動相，進(jìn)行等度洗脫。固定流動相的流速為0.8 mL/min。為了選擇最佳的流動相配比，改變流動相中甲醇的比例，使其體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，測定胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間和峰面積。

1.2.5pH值的確定常用來調(diào)節(jié)流動相pH值的化合物有磷酸、醋酸、磷酸鹽緩沖溶液和醋酸鹽緩沖溶液。本試驗采用磷酸來調(diào)節(jié)pH值而不采用醋酸的主要原因是磷酸的紫外吸收較小且屬于中等強酸，等量的0.1%磷酸溶液和1%醋酸溶液的pH值相等，除此之外，磷酸還不損壞色譜儀器的接口。

用磷酸調(diào)節(jié)水相的pH值分別為2、3、4、5、6、7，加入流動相中的有機相和水相的體積比為1 ∶1，測定不同pH值下胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間和峰面積。

1.2.6柱溫的選擇本試驗考察了溫度對色譜分離的影響，在選定的上述條件下，分別在柱溫為18、22、26、30、34、38、42 ℃ 時測定胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間和峰面積。

1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用甲醇稀釋200 μg/mL胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備質(zhì)量濃度為10、20、50、100、120、150 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，按照上述確定的色譜條件測定標(biāo)準(zhǔn)品系列工作溶液的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作工作曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.8精密度試驗取質(zhì)量濃度分別10、50、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照已經(jīng)確定的色譜條件，各進(jìn)樣3次，分別測定峰面積并計算胡桃醌濃度、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.9穩(wěn)定性試驗將20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液放置在室溫條件下，不做任何避光保護(hù)，每隔2 h進(jìn)樣測定1次，共進(jìn)行5次，分別測定其峰面積并計算胡桃醌濃度、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.10重復(fù)性試驗取20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，分別測定峰面積并計算胡桃醌濃度、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。endprint

1.2.11加標(biāo)回收率試驗分別取3份5 mL 50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.5、0.8、1.0 mL 200 μg/mL胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述進(jìn)樣方法操作，測定其峰面積，重復(fù)測定3次，計算平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的測定和選擇

由圖1可知，胡桃醌的最大吸收波長出現(xiàn)在250 nm左右，此時受干擾較少。因此選擇250 nm為測定波長。

2.2流動相組成的影響試驗

從圖2可以看出，隨著水的比例增加，流動相的極性增大，保留時間也延長。當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)小于50%時，分析時間過長，峰形開始逐漸變差。綜合以上情況，選用甲醇的體積分?jǐn)?shù)為50%（即甲醇與水體積比為1 ∶1）。

2.3pH值的影響試驗

流動相中水相的pH值在2～7范圍對胡桃醌的保留時間（圖3）和峰面積都沒有太大的影響，但當(dāng)pH值為4時，峰型較好，因此本試驗中選取水相的pH值為4。

2.4柱溫的選擇試驗

試驗結(jié)果（圖4）表明：隨著溫度升高，各物質(zhì)之間的分離效果有所提高，當(dāng)溫度高于30℃，分離效果隨著溫度升高變

化不再明顯，考慮到色譜柱使用溫度條件，選擇柱溫30 ℃。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作工作曲線，得到圖5，對曲線進(jìn)行線性擬合，得到胡桃醌含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），表明胡桃醌在 10～150 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗

由表1可知，高、中、低3個不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品溶液RSD值均小于2%，表明儀器及進(jìn)樣的精密度良好。

參考文獻(xiàn)：

[1]許紹惠，許弘. 胡桃屬植物毒性成分及其應(yīng)用[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，21（2）：167-170.

[2]朱明華，胡坪. 儀器分析[M]. 北京：高等教育出版社，2008：66-67.

[3]孟霞. 高效液相色譜法在幾種藥用植物分析中的應(yīng)用研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2009.高淵，朱君，呂飛，等. 江蘇口岸截獲入境皮蠹疫情分析 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：261-262.endprint

1.2.11加標(biāo)回收率試驗分別取3份5 mL 50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.5、0.8、1.0 mL 200 μg/mL胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述進(jìn)樣方法操作，測定其峰面積，重復(fù)測定3次，計算平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的測定和選擇

由圖1可知，胡桃醌的最大吸收波長出現(xiàn)在250 nm左右，此時受干擾較少。因此選擇250 nm為測定波長。

2.2流動相組成的影響試驗

從圖2可以看出，隨著水的比例增加，流動相的極性增大，保留時間也延長。當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)小于50%時，分析時間過長，峰形開始逐漸變差。綜合以上情況，選用甲醇的體積分?jǐn)?shù)為50%（即甲醇與水體積比為1 ∶1）。

2.3pH值的影響試驗

流動相中水相的pH值在2～7范圍對胡桃醌的保留時間（圖3）和峰面積都沒有太大的影響，但當(dāng)pH值為4時，峰型較好，因此本試驗中選取水相的pH值為4。

2.4柱溫的選擇試驗

試驗結(jié)果（圖4）表明：隨著溫度升高，各物質(zhì)之間的分離效果有所提高，當(dāng)溫度高于30℃，分離效果隨著溫度升高變

化不再明顯，考慮到色譜柱使用溫度條件，選擇柱溫30 ℃。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作工作曲線，得到圖5，對曲線進(jìn)行線性擬合，得到胡桃醌含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），表明胡桃醌在 10～150 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗

由表1可知，高、中、低3個不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品溶液RSD值均小于2%，表明儀器及進(jìn)樣的精密度良好。

參考文獻(xiàn)：

[1]許紹惠，許弘. 胡桃屬植物毒性成分及其應(yīng)用[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，21（2）：167-170.

[2]朱明華，胡坪. 儀器分析[M]. 北京：高等教育出版社，2008：66-67.

[3]孟霞. 高效液相色譜法在幾種藥用植物分析中的應(yīng)用研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2009.高淵，朱君，呂飛，等. 江蘇口岸截獲入境皮蠹疫情分析 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：261-262.endprint

1.2.11加標(biāo)回收率試驗分別取3份5 mL 50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.5、0.8、1.0 mL 200 μg/mL胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述進(jìn)樣方法操作，測定其峰面積，重復(fù)測定3次，計算平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的測定和選擇

由圖1可知，胡桃醌的最大吸收波長出現(xiàn)在250 nm左右，此時受干擾較少。因此選擇250 nm為測定波長。

2.2流動相組成的影響試驗

從圖2可以看出，隨著水的比例增加，流動相的極性增大，保留時間也延長。當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)小于50%時，分析時間過長，峰形開始逐漸變差。綜合以上情況，選用甲醇的體積分?jǐn)?shù)為50%（即甲醇與水體積比為1 ∶1）。

2.3pH值的影響試驗

流動相中水相的pH值在2～7范圍對胡桃醌的保留時間（圖3）和峰面積都沒有太大的影響，但當(dāng)pH值為4時，峰型較好，因此本試驗中選取水相的pH值為4。

2.4柱溫的選擇試驗

試驗結(jié)果（圖4）表明：隨著溫度升高，各物質(zhì)之間的分離效果有所提高，當(dāng)溫度高于30℃，分離效果隨著溫度升高變

化不再明顯，考慮到色譜柱使用溫度條件，選擇柱溫30 ℃。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作工作曲線，得到圖5，對曲線進(jìn)行線性擬合，得到胡桃醌含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），表明胡桃醌在 10～150 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗

由表1可知，高、中、低3個不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品溶液RSD值均小于2%，表明儀器及進(jìn)樣的精密度良好。

參考文獻(xiàn)：

[1]許紹惠，許弘. 胡桃屬植物毒性成分及其應(yīng)用[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，21（2）：167-170.

[2]朱明華，胡坪. 儀器分析[M]. 北京：高等教育出版社，2008：66-67.

[3]孟霞. 高效液相色譜法在幾種藥用植物分析中的應(yīng)用研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2009.高淵，朱君，呂飛，等. 江蘇口岸截獲入境皮蠹疫情分析 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：261-262.endprint