趙會(huì)彥　肖麓　杜德志

摘要：青海大黃油菜是青藏高原特有的一個(gè)白菜型油菜地方品種，具有黃籽的優(yōu)良性狀。前人研究結(jié)果表明大黃油菜黃籽性狀受一對(duì)隱性基因Brsc1控制。該基因被定位于白菜型油菜的A9染色體上。為了篩選更多與Brsc1緊密連鎖的標(biāo)記，本研究根據(jù)Brsc1所在染色體區(qū)間，依據(jù)BRAD數(shù)據(jù)庫中已公布的白菜型油菜的序列信息（http：//brassicadb.org/brad/），設(shè)計(jì)新的SSR引物，同時(shí)利用同源區(qū)間內(nèi)已有的SSR引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)一步精細(xì)定位。以大黃油菜和褐籽油菜09A-126為親本，構(gòu)建BC1分離群體和F2群體，結(jié)合BSA法，對(duì)SSR引物進(jìn)行檢測(cè)，共篩選到5個(gè)與Brsc1基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記：A-11-65、A-11-145、B-6-32、BrID10607和KS10760，其中A-11-65為共顯性標(biāo)記。構(gòu)建了Brsc1的SSR標(biāo)記遺傳圖譜和物理圖譜，圖譜標(biāo)記密度較前人進(jìn)一步增加。這些標(biāo)記的獲得為油菜黃籽品種分子標(biāo)記輔助選擇育種體系的建立和黃籽基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青海大黃油菜；黃籽基因；SSR；遺傳圖譜；物理圖譜

中圖分類號(hào)： S565.401文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0032-04

收稿日期：2013-05-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31060196）；國家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2011AA10A104）；國家“973”計(jì)劃（編號(hào)：2012CB723007）；國家油菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-13）。

作者簡介：趙會(huì)彥（1989—），男，河南南陽人，碩士研究生，主要從事春油菜分子生物學(xué)研究。E-mail：13639767407@163.com。

通信作者：肖麓，博士。 E-mail：981919669@qq.com。油菜是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物之一，也是我國食用植物油的重要來源。油菜種皮顏色有黃色、褐色、黑色等，研究結(jié)果表明，在相同遺傳背景下，黃籽油菜與黑、褐籽等油菜相比，具有種皮薄，皮殼率低，蛋白質(zhì)和含油量高，色素含量少等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。白菜型黃籽油菜為自然界存在的天然黃籽資源之一，對(duì)白菜型油菜黃籽基因進(jìn)行定位，開發(fā)與黃籽基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，構(gòu)建黃籽基因的遺傳連鎖圖譜和物理圖譜，對(duì)黃籽油菜分子標(biāo)記輔助選擇育種體系的建立、黃籽基因的圖位克隆以及轉(zhuǎn)基因油菜品種的培育等都具有重要的意義[3-7]。Chen等利用印度黃籽沙遜構(gòu)建白菜-芥藍(lán)（B. campestris-B. alboglabra）C染色體組異附加系，并利用該異附加系篩選出一個(gè)與黃籽基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記B06-600[8]。Rahman等在白菜型黃籽沙遜油菜中發(fā)現(xiàn)1個(gè)與黃籽性狀主效基因（Br1/br1）緊密連鎖的SRAP標(biāo)記SA7BG29-245，并將這個(gè)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性SNP（單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記和SCAR（序列特異性擴(kuò)增區(qū)域）標(biāo)記[9]。Zhang等利用大白菜雙單倍體群體進(jìn)行黃籽基因的精細(xì)定位和圖位克隆，用13個(gè)SRAP標(biāo)記、6個(gè)SCAR標(biāo)記和4個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建了黃籽基因的遺傳連鎖圖譜，克隆了控制種皮顏色的基因，該基因位于白菜型油菜A6連鎖群[10]。Kebede等對(duì)白菜型黃籽沙遜油菜種皮顏色基因進(jìn)行了QTL定位，共檢測(cè)到4個(gè)QTL位點(diǎn)，其中一個(gè)主效QTL位點(diǎn)SCA9-2和一個(gè)微效QTL位點(diǎn)SCA9-1位于A9連鎖群，其他兩個(gè)微效QTL位點(diǎn)（SCA3-1和SCA5-1）分別位于A3和A5連鎖群，共解釋了67%的表型變異[11]。Xiao等對(duì)青海大黃油菜黃籽性狀進(jìn)行了遺傳分析和基因定位研究，結(jié)果表明青海大黃油菜黃籽性狀受一對(duì)隱性基因（Brsc1）控制，篩選到與Brsc1緊密連鎖的10個(gè)AFLP標(biāo)記（Y1至Y10）和3個(gè)SSR標(biāo)記（CB10255、CB10022、CB10428），將其定位于白菜型油菜A9染色體上，同時(shí)構(gòu)建了Brsc1基因所在區(qū)域的遺傳連鎖圖譜[12]。

綜上所述可見，前人對(duì)不同的白菜型黃籽油菜品種的黃籽基因進(jìn)行了定位、克隆等研究，但是對(duì)于不同油菜品種的研究結(jié)果有所不同。本研究所用青海大黃油菜是起源于青藏高原的白菜型油菜地方品種，有能夠穩(wěn)定遺傳的黃籽性狀，是一種研究白菜型油菜黃籽性狀的優(yōu)異種質(zhì)資源[13-14]。前人將大黃油菜黃籽基因Brsc1定位于A9染色體上特定區(qū)段，但標(biāo)記數(shù)目有限，圖譜飽和度不夠。本研究在前人研究的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步擴(kuò)大作圖群體，結(jié)合分離體分組混合分析法（bulked segregant analysis，BSA法），在Brsc1所在染色體區(qū)段篩選新的與Brsc1連鎖更為緊密的SSR標(biāo)記，增加與Brsc1基因緊密連鎖標(biāo)記的數(shù)目，提高Brsc1遺傳連鎖圖譜的標(biāo)記密度，為大黃油菜黃籽基因的克隆創(chuàng)造條件。同時(shí)，檢測(cè)所獲SSR標(biāo)記是否為共顯性標(biāo)記，用于大黃油菜分子標(biāo)記輔助選擇育種體系的建立。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和群體構(gòu)建

本研究所用親本材料為青海大黃油菜和一個(gè)白菜型油菜褐籽品系（編號(hào)09A-126），由青海省農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供。兩親本均已連續(xù)自交或兄妹交8代以上，其種皮顏色性狀均可穩(wěn)定遺傳。以大黃油菜為母本，09A-126為父本，F(xiàn)1代與大黃油菜回交，構(gòu)建BC1群體，作為定位群體；F1同時(shí)自交，獲得F2群體，F(xiàn)2中每一單株套袋自交獲得F2：3家系，用于與目標(biāo)基因連鎖的共顯性標(biāo)記的篩選。

1.2DNA提取和性狀調(diào)查分組

油菜苗期，采用CTAB法提取葉片總DNA[15]。測(cè)定每份DNA溶液的濃度，稀釋至50 ng/μL，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

油菜角果完全成熟后，分單株收獲，晾干后考種。通過肉眼觀察，考查每一單株的種皮顏色。根據(jù)考查結(jié)果，將BC1群體單株分為黃籽和褐籽兩組。隨機(jī)選取12個(gè)黃籽單株和12個(gè)褐籽單株，將單株DNA等量混合，分別構(gòu)建兩個(gè)黃籽基因池和兩個(gè)褐籽基因池。根據(jù)F2群體中各單株的種皮顏色性狀，將F2群體首先分為黃籽和褐籽兩組，再根據(jù)F2 ∶3家系性狀，將F2群體中的褐籽單株分為純合褐籽（性狀不分離）和雜合褐籽（性狀分離）兩組，最終將F2群體分為黃籽、雜合褐籽和純合褐籽3組。

1.3SSR標(biāo)記開發(fā)與檢測(cè)

根據(jù)前人的研究結(jié)果，Brsc1被定位在白菜型油菜A9染色體上的一段2.8 Mb的區(qū)間內(nèi)。從BRAD數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/）下載Brsc1所在區(qū)間的序列信息，利用SSRHunter 1.3軟件，進(jìn)行微衛(wèi)星篩選。然后利用Primer 3軟件設(shè)計(jì)SSR引物（http：//frodo.wi.mit.edu/）。同時(shí)利用BRAD數(shù)據(jù)庫中Brsc1所在區(qū)間內(nèi)已有的SSR標(biāo)記在我們的定位群體中進(jìn)行多態(tài)性分析[16-19]。SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。SSR擴(kuò)增反應(yīng)參照梅德圣等的方法[20]。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。SSR引物首先在2對(duì)基因池中進(jìn)行檢測(cè)，表現(xiàn)為多態(tài)性的引物繼續(xù)在BC1分離群體的單株中進(jìn)一步進(jìn)行分析，若仍然表現(xiàn)多態(tài)性，則確定為與Brsc1基因緊密連鎖的標(biāo)記。獲得的特異SSR引物同時(shí)用F2群體中的單株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否為共顯性標(biāo)記。

1.4SSR標(biāo)記遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建

特異性SSR標(biāo)記在BC1分離群體中進(jìn)行重組單株的篩選，計(jì)算重組率，利用Kosamabi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離[21]。利用MAPMAKER/EXP3.0軟件，構(gòu)建Brsc1的SSR標(biāo)記遺傳圖譜，并利用MapDraw V2.1作圖軟件進(jìn)行遺傳圖譜和物理圖譜的繪制[22]。

2結(jié)果與分析

2.1SSR標(biāo)記開發(fā)與篩選結(jié)果

前人將Brsc1定位于A9染色體上Y06（19.3 Mb）和Y10（22.1 Mb）之間2.8 Mb的區(qū)間內(nèi)。從BRAD數(shù)據(jù)庫下載該區(qū)間部分序列，用于SSR引物的設(shè)計(jì)，并下載該區(qū)間已公布的SSR標(biāo)記。用黃籽/褐籽基因池和BC1分離群體單株進(jìn)行檢測(cè)，共獲得5個(gè)與Brsc1緊密連鎖的特異性SSR標(biāo)記：A-11-65、A-11-145、B-6-32、BrID10607和KS10760，引物序列信息見表1。 各特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，條帶多態(tài)性明顯，帶型清晰穩(wěn)定，圖1和圖2所示分別為引物BrID10607和KS10760擴(kuò)增結(jié)果。同時(shí)，5個(gè)特異性SSR標(biāo)記對(duì)F2群體中的單株進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，A-11-65為共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分黃籽、雜合褐籽和純合褐籽單株（圖3）。表1與青海大黃油菜黃籽基因Brsc1緊密連鎖的SSR標(biāo)記

SSR標(biāo)記1引物名稱1引物序列（5 ′→3′）1遺傳距離

2.2SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜和物理圖譜的構(gòu)建

本研究所構(gòu)建BC1作圖分離群體包含1 740個(gè)單株，6個(gè)與Brsc1表現(xiàn)連鎖的SSR標(biāo)記在BC1群體中進(jìn)行重組單株的篩選，計(jì)算重組率，確定各連鎖標(biāo)記與Brsc1之間的遺傳距離（表1）。將6個(gè)SSR標(biāo)記與前人對(duì)Brsc1的定位結(jié)果進(jìn)行比較和整合，構(gòu)建Brsc1的遺傳連鎖圖譜（圖4）。各連鎖SSR標(biāo)記的物理位置見表1，使用作圖軟件繪制其物理圖譜（圖4）。新開發(fā)的6個(gè)SSR連鎖標(biāo)記位于Brsc1同側(cè)，與Brsc1間的平均遺傳距離為0.012 2，連鎖緊密。新開發(fā)的SSR標(biāo)記覆蓋染色體上0.9 Mb的長度，圖譜標(biāo)記密度進(jìn)一步增加。

3討論

與前人所獲得的分子標(biāo)記相比，本研究篩選得到的5個(gè)與目標(biāo)基因Brsc1緊密連鎖的SSR標(biāo)記與Brsc1之間的遺傳距離進(jìn)一步縮短，最近的標(biāo)記為KS10760（0.005 7 cM）。將新獲得的SSR標(biāo)記與前人研究所得Brsc1的遺傳連鎖圖譜進(jìn)行整合，圖譜標(biāo)記密度進(jìn)一步增加。高密度的遺傳圖譜是實(shí)現(xiàn)Brsc1圖位克隆的關(guān)鍵。新開發(fā)的SSR標(biāo)記位于Brsc1同側(cè)，要實(shí)現(xiàn)Brsc1的克隆，在Brsc1另一側(cè)還須開發(fā)更多與 Brsc1 距離更近的分子標(biāo)記，將Brsc1鎖定于更小的范圍內(nèi)。本研究所用作圖分離群體較前人有所擴(kuò)大，作圖群體的擴(kuò)大使連鎖標(biāo)記與目標(biāo)基因之間的遺傳距離測(cè)算更為準(zhǔn)確，圖譜精度進(jìn)一步提高，且為連鎖更緊密的分子標(biāo)記的開發(fā)創(chuàng)造了條件。

Xiao等所得與Brsc1 緊密連鎖的SSR標(biāo)記，距離最近的為CB10022（0.8 cM），本研究新開發(fā)的SSR標(biāo)記不但與Brsc1之間遺傳距離大大縮短，而且得到一個(gè)共顯性標(biāo)記A-11-65（0.008 0 cM）。由于SSR標(biāo)記具有操作簡單，重復(fù)性好，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。本研究所得到的SSR標(biāo)記，不但與Brsc1連鎖緊密，而且擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，尤其是共顯性標(biāo)記的獲得，能較準(zhǔn)確地區(qū)分不同基因型的單株，因此很適用于建立白菜型黃籽油菜分子標(biāo)記輔助選擇育種體系。不足之處在于沒有篩選到與Brsc1共分離的SSR標(biāo)記，SSR連鎖標(biāo)記的數(shù)目也不夠多，為提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確率，還需要開發(fā)更多與Brsc1緊密連鎖的分子標(biāo)記。

本研究利用新開發(fā)的SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，這些標(biāo)記是根據(jù)目標(biāo)基因所在特定區(qū)段的序列信息進(jìn)行開發(fā)的。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，植物基因組序列信息數(shù)據(jù)庫的不斷完善，通過搜索數(shù)據(jù)庫序列信息開發(fā)SSR引物越來越普遍。利用該方法進(jìn)行目標(biāo)基因的定位，目的性強(qiáng)，可快速篩選出與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。但該方法需要以一定的定位結(jié)果為基礎(chǔ)，并且需將目標(biāo)基因鎖定于較小的區(qū)段內(nèi)，否則會(huì)增加SSR標(biāo)記開發(fā)和篩選的難度。該方法還可用于開發(fā)SCAR、IP標(biāo)記等，適用于目標(biāo)基因的精細(xì)定位。

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