魏福倫　朱里鵬　王慶容

摘要：以患病鱸魚為材料，從中分離出7株真菌，再篩選出3株真菌，采用形態(tài)學特征及分子生物學方法對它們進行鑒定；進一步對其生物學特性進行初步研究，確定其生長的最適溫度和pH值。鑒定結果表明，篩選出的3株真菌分別為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）、變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）和銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。毛霉生長的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長；低于10 ℃時枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長，而高于37 ℃對其生長影響不大。分離到的3種菌株生長的最適pH值是中性偏酸性。

關鍵詞：鱸魚；可疑性致病真菌；分離鑒定；生物學特性

中圖分類號： S917.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0187-03

收稿日期：2013-05-08

基金項目：貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設項目[編號：黔科合人才團隊（2012）4004]；貴州省遵義市科技局項目[編號：遵市科合社字（2009）26號]。

作者簡介：魏福倫（1964—），男，貴州習水人，高級實驗師，主要從事經濟動物飼養(yǎng)及病害預防的教學和研究工作。E-mail：1050089863@qq.com。

通信作者：王慶容，副教授，主要從事魚類分子生物學及病害預防的研究工作。E-mail：wqr_1025@163.com。鱸魚（Lateolabrax japonicus）屬于脊索動物門、魚綱，別稱花鱸、鱸板、花寨、鱸子魚，為常見的經濟魚類之一，也是發(fā)展海水養(yǎng)殖的品種[1]。它主要生活在近岸淺海中下層，常棲息于河口咸淡水處，也可生活于淡水中。春夏間幼魚有成群溯河習性，冬季返歸海中，主食魚、蝦類。真菌性疾病是困擾鱸魚養(yǎng)殖較嚴重的病害之一[1]，其危害遍及鱸魚身體的各個部分，但最常見的危害部位是體表，所以對鱸魚體表寄生的真菌進行分離和鑒定顯得尤為重要。

真菌是與人們的生產和生活密切相關的類群，許多種類可以食用和藥用，但也有有害的一面，如引起人、畜中毒，尤其是引起皮膚病和內臟病等。為了更好地開發(fā)利用或預防它們，對它們作出準確的鑒定尤為必要。大部分菌物的種類多、分布廣、形態(tài)特征復雜，且少數生理生化指標和形態(tài)特征會隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，導致鑒定費時費力并且不準確。隨著生物技術的發(fā)展，尤其是分子生物學和生物信息學等相關學科的迅速發(fā)展，一系列分子生物學方法逐漸被應用到真菌的分類鑒定中[2]，其中rDNA序列分析是目前真菌分類鑒定中常用的方法，它通過測定真菌rDNA序列的一級結構，將其輸入GenBank數據庫與同源序列比較來確定其種屬關系。將傳統(tǒng)分類方法與分子鑒定相結合，可以使真菌分類鑒定更加快速、穩(wěn)定、可靠。本研究以患病鱸魚為材料，先擴增分離所得菌株的18S rRNA基因，測定其序列，將測序結果輸入GenBank數據庫，通過同源性比對確定該菌株所在的屬，再根據其形態(tài)特征和顯微結構鑒定到種。在此基礎上，初步研究它們在不同溫度和pH值的生長狀況，為更好地開發(fā)利用或預防它們提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

烏江偏巖河段網箱養(yǎng)殖場的病害鱸魚。

1.2菌株的分離和培養(yǎng)

選取幾條體表有真菌侵害癥狀的鱸魚，分別用無菌水清洗后，用滅菌棉簽蘸取損傷部位，用劃線法接種到的PDA平板上（每次接種設3個重復）。25 ℃培養(yǎng)，待其長出菌落后，挑取菌落劃線轉接到另一PDA平板上，多次轉板直到培養(yǎng)基上只生長1種菌落。

1.3菌株的分子鑒定

1.3.1真菌DNA的提取將篩選出的真菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上常溫下培養(yǎng)3 d，從平板上挑取新鮮菌絲放于研磨鍋中，加入700 μL的2%CTAB溶液，用滅菌石英砂研磨菌絲體，轉移于2 mL的EP管中，在恒溫水浴鍋上于65 ℃下保溫30 min（每10 min振蕩1次），離心加等體積氯仿-異戊醇混合液（氯仿 ∶異戊醇體積比24 ∶1）輕輕充分搖勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min。取上清液至一新EP管中，加等體積的異丙醇在常溫下靜置30 min，12 000 r/min離心10 min。取上清液至一新EP管中，加2倍體積的75%乙醇沉淀DNA，7 500 r/min 離心5 min，倒去上清液后，在室溫下晾干，將DNA溶解于50 μL TE緩沖液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.218S rRNA基因的PCR擴增擴增使用的引物是通用引物NS1與NS6[3]，NS1引物序列為5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′，NS6引物序列為5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC-3′。PCR 擴增體系（50 μL）：10 μmol/L引物各2 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTP 4 μL，10× buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 34.5 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃復性 50 s，72 ℃ 延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司測序，測序引物為擴增引物，測序方法為引物行走法。

1.3.3菌株的分子鑒定將菌株的18S rRNA基因序列輸入GenBank數據庫，用BLAST工具對序列進行同源性比對分析，同時用MEGA 5.1進行分子發(fā)育系統(tǒng)樹的構建。

1.4菌株的形態(tài)學鑒定

將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～12 d，每天觀察菌落形態(tài)與顏色，再在顯微鏡下觀察其產孢結構、分生孢子梗著生情況及孢子形態(tài)、大小、顏色等。

1.5菌株的生物學特性初步研究

1.5.1菌株在不同溫度的生長狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2菌株在不同pH值下的生長狀況將真菌接種在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng) 3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結果與分析

2.1鱸魚體表可疑性致病真菌的分離結果

從鱸魚體表一共分離出7株可疑性致病真菌，根據菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR擴增及分子鑒定結果

3個菌株18S rRNA基因的PCR擴增結果見圖1，3個菌株都擴增出約1 500 bp的片段。將3個菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中（鱸體表1的登錄號為KC977560，鱸體表3的登錄號為KC977562，鱸體表7的登錄號為KC977559），分子鑒定結果見表1。將3個菌株18S rRNA基因序列與NCBI數據庫中的同源序列用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從表1和圖2可以看出，鱸體表1屬于枝孢屬，鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1鱸體表1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑為1.30～1.45cm，鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面

有不規(guī)則皺褶，37℃生長良好。在Sabouand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色（圖3-a）。菌絲灰棕色，叢

生，不分隔（圖3-b）。分生孢子橢圓形、枝孢梨形、鏈生，形成彎曲的芽生孢子短鏈（圖3-c、圖3-d）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為叢梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢屬（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鱸體表3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長迅速，無假根，孢子囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，孢子囊梗分枝，全部頂生孢子囊（圖4-a）；菌叢較高，軟弱，先呈白色，后變灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常無菌絲孢子，囊膜易融化，主梗不作軸狀分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊軸（圖4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，卵形至圓形，壁薄，平滑（圖4-c）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鱸體表7的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲萌發(fā)時白色，后變?yōu)辄S色轉褐色，背面磚紅色。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，合軸分枝（圖5-a）；孢子囊大，球形，頂生，囊柄易凋萎（圖5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊軸；孢囊孢子橢圓形，壁薄，平滑（圖5-c）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物學特性

2.4.1不同溫度對3種真菌生長速率的影響由表2可以看出，不同溫度條件下不同真菌的生長速率不同：3種菌株在5 ℃時都基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25 ℃左右是真菌生長的最適溫度。37 ℃以上時，枝孢屬的鱸體表1生長旺盛，生長速率幾乎不受影響，而毛霉屬的鱸體表3和鱸體表7幾乎不能生長。

表2不同溫度對3種真菌生長速率的影響

菌株編號1不同溫度下的生長速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鱸體表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鱸體表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鱸體表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值對3種真菌生長速率的影響由表3可以看出，不同pH值條件下不同真菌的生長速率不同：3種菌株在pH值為4～7時均能生長，鱸體表1和鱸體表7在pH值為5時生長最快，鱸體表3在pH值為6時生長最快，在其他pH值條件下生長速率有所下降。總體來說，分離到的3種菌

3討論

從患病鱸魚體表中共分離出7株真菌，根據菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7，根據分子鑒定結果和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定出鱸體表1屬于枝孢屬（Cladosporium），鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）。再結合形態(tài)學特征和顯微結構特點，進一步確定鱸體表1為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鱸體表3為變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鱸體表7為銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復雜，且少數形態(tài)特征和生理生化指標隨著環(huán)境的變

化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結果有一定偏差，增加了鑒定難度，今后可以嘗試用多種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，以求增加鑒定結果的可靠性。

對分離并鑒定的3種菌株進行生物學特性的初步研究，將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，發(fā)現毛霉生長的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長；低于10 ℃時枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長，而高于37 ℃對其生長影響不大。將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現分離到的3種菌株生長的最適pH值是中性偏酸性。

鱸魚體表常見的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些種類[6]。本研究從鱸魚體表的病害部位采集標本，共分離到7種菌株，根據肉眼觀察菌落形態(tài)進行取舍，在篩選出的3種菌株中沒有水霉，可能人為取舍時將水霉丟掉了，也可能是因培養(yǎng)基種類的原因而沒有分離到水霉。篩選出的3種菌株中，斑替枝孢霉在人體主要引起腦部的暗色絲孢霉病，肺部和皮膚感染較少見[7]，也沒有見到在魚體上分離到的報道。毛霉屬的某些種類能引起人類或其他動物患皮膚病，但變孢毛霉和銹色毛霉是否能引起鱸魚患皮膚病還有待于進一步確認。

參考文獻：

[1]楊秀榮，王慶容.烏江偏巖河段網箱養(yǎng)魚病害現狀與防治對策[J]. 遵義師范學院學報，2008，10（4）：43-44.

[2]林劍偉，闕友雄，陳天生，等. 核糖體DNA的內轉錄間隔區(qū)序列標記在真菌分類鑒定中的應用[J]. 生物技術通訊，2007，18（2）：292-294.

[3]周小玲，沈微，饒志明，等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學通報，2004，31（4）：89-92.

[4]張中義.中國真菌志：第34卷：枝孢屬[M]. 北京：科學出版社，2003.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979.

[6]金珊，王國良，趙青松，等. 海水網箱養(yǎng)殖鱸魚的主要疾病與防治[J]. 浙江海洋學院學報：自然科學版，2000，19（1）：51-54.

[7]秦振宇，吳紹熙，譚升順. 淺析致病真菌分類的動態(tài)性[J]. 國外醫(yī)學：皮膚性病學分冊，2000，26（1）：31-34.林小園，劉紅全，袁衛(wèi)生. 海洋微藻的玻璃化凍存技術研究進展[J]. 江蘇農業(yè)科學，2014，42（1）：190-194.

1.5.1菌株在不同溫度的生長狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2菌株在不同pH值下的生長狀況將真菌接種在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng) 3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結果與分析

2.1鱸魚體表可疑性致病真菌的分離結果

從鱸魚體表一共分離出7株可疑性致病真菌，根據菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR擴增及分子鑒定結果

3個菌株18S rRNA基因的PCR擴增結果見圖1，3個菌株都擴增出約1 500 bp的片段。將3個菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中（鱸體表1的登錄號為KC977560，鱸體表3的登錄號為KC977562，鱸體表7的登錄號為KC977559），分子鑒定結果見表1。將3個菌株18S rRNA基因序列與NCBI數據庫中的同源序列用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從表1和圖2可以看出，鱸體表1屬于枝孢屬，鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1鱸體表1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑為1.30～1.45cm，鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面

有不規(guī)則皺褶，37℃生長良好。在Sabouand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色（圖3-a）。菌絲灰棕色，叢

生，不分隔（圖3-b）。分生孢子橢圓形、枝孢梨形、鏈生，形成彎曲的芽生孢子短鏈（圖3-c、圖3-d）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為叢梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢屬（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鱸體表3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長迅速，無假根，孢子囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，孢子囊梗分枝，全部頂生孢子囊（圖4-a）；菌叢較高，軟弱，先呈白色，后變灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常無菌絲孢子，囊膜易融化，主梗不作軸狀分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊軸（圖4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，卵形至圓形，壁薄，平滑（圖4-c）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鱸體表7的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲萌發(fā)時白色，后變?yōu)辄S色轉褐色，背面磚紅色。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，合軸分枝（圖5-a）；孢子囊大，球形，頂生，囊柄易凋萎（圖5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊軸；孢囊孢子橢圓形，壁薄，平滑（圖5-c）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物學特性

2.4.1不同溫度對3種真菌生長速率的影響由表2可以看出，不同溫度條件下不同真菌的生長速率不同：3種菌株在5 ℃時都基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25 ℃左右是真菌生長的最適溫度。37 ℃以上時，枝孢屬的鱸體表1生長旺盛，生長速率幾乎不受影響，而毛霉屬的鱸體表3和鱸體表7幾乎不能生長。

表2不同溫度對3種真菌生長速率的影響

菌株編號1不同溫度下的生長速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鱸體表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鱸體表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鱸體表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值對3種真菌生長速率的影響由表3可以看出，不同pH值條件下不同真菌的生長速率不同：3種菌株在pH值為4～7時均能生長，鱸體表1和鱸體表7在pH值為5時生長最快，鱸體表3在pH值為6時生長最快，在其他pH值條件下生長速率有所下降?？傮w來說，分離到的3種菌

3討論

從患病鱸魚體表中共分離出7株真菌，根據菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7，根據分子鑒定結果和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定出鱸體表1屬于枝孢屬（Cladosporium），鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）。再結合形態(tài)學特征和顯微結構特點，進一步確定鱸體表1為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鱸體表3為變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鱸體表7為銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復雜，且少數形態(tài)特征和生理生化指標隨著環(huán)境的變

化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結果有一定偏差，增加了鑒定難度，今后可以嘗試用多種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，以求增加鑒定結果的可靠性。

對分離并鑒定的3種菌株進行生物學特性的初步研究，將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，發(fā)現毛霉生長的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長；低于10 ℃時枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長，而高于37 ℃對其生長影響不大。將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現分離到的3種菌株生長的最適pH值是中性偏酸性。

鱸魚體表常見的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些種類[6]。本研究從鱸魚體表的病害部位采集標本，共分離到7種菌株，根據肉眼觀察菌落形態(tài)進行取舍，在篩選出的3種菌株中沒有水霉，可能人為取舍時將水霉丟掉了，也可能是因培養(yǎng)基種類的原因而沒有分離到水霉。篩選出的3種菌株中，斑替枝孢霉在人體主要引起腦部的暗色絲孢霉病，肺部和皮膚感染較少見[7]，也沒有見到在魚體上分離到的報道。毛霉屬的某些種類能引起人類或其他動物患皮膚病，但變孢毛霉和銹色毛霉是否能引起鱸魚患皮膚病還有待于進一步確認。

參考文獻：

[1]楊秀榮，王慶容.烏江偏巖河段網箱養(yǎng)魚病害現狀與防治對策[J]. 遵義師范學院學報，2008，10（4）：43-44.

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[3]周小玲，沈微，饒志明，等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學通報，2004，31（4）：89-92.

[4]張中義.中國真菌志：第34卷：枝孢屬[M]. 北京：科學出版社，2003.

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[7]秦振宇，吳紹熙，譚升順. 淺析致病真菌分類的動態(tài)性[J]. 國外醫(yī)學：皮膚性病學分冊，2000，26（1）：31-34.林小園，劉紅全，袁衛(wèi)生. 海洋微藻的玻璃化凍存技術研究進展[J]. 江蘇農業(yè)科學，2014，42（1）：190-194.

1.5.1菌株在不同溫度的生長狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2菌株在不同pH值下的生長狀況將真菌接種在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng) 3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結果與分析

2.1鱸魚體表可疑性致病真菌的分離結果

從鱸魚體表一共分離出7株可疑性致病真菌，根據菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR擴增及分子鑒定結果

3個菌株18S rRNA基因的PCR擴增結果見圖1，3個菌株都擴增出約1 500 bp的片段。將3個菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中（鱸體表1的登錄號為KC977560，鱸體表3的登錄號為KC977562，鱸體表7的登錄號為KC977559），分子鑒定結果見表1。將3個菌株18S rRNA基因序列與NCBI數據庫中的同源序列用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從表1和圖2可以看出，鱸體表1屬于枝孢屬，鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1鱸體表1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑為1.30～1.45cm，鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面

有不規(guī)則皺褶，37℃生長良好。在Sabouand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色（圖3-a）。菌絲灰棕色，叢

生，不分隔（圖3-b）。分生孢子橢圓形、枝孢梨形、鏈生，形成彎曲的芽生孢子短鏈（圖3-c、圖3-d）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為叢梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢屬（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鱸體表3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長迅速，無假根，孢子囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，孢子囊梗分枝，全部頂生孢子囊（圖4-a）；菌叢較高，軟弱，先呈白色，后變灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常無菌絲孢子，囊膜易融化，主梗不作軸狀分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊軸（圖4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，卵形至圓形，壁薄，平滑（圖4-c）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鱸體表7的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲萌發(fā)時白色，后變?yōu)辄S色轉褐色，背面磚紅色。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，合軸分枝（圖5-a）；孢子囊大，球形，頂生，囊柄易凋萎（圖5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊軸；孢囊孢子橢圓形，壁薄，平滑（圖5-c）。依據形態(tài)學特征，結合分子鑒定結果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物學特性

2.4.1不同溫度對3種真菌生長速率的影響由表2可以看出，不同溫度條件下不同真菌的生長速率不同：3種菌株在5 ℃時都基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25 ℃左右是真菌生長的最適溫度。37 ℃以上時，枝孢屬的鱸體表1生長旺盛，生長速率幾乎不受影響，而毛霉屬的鱸體表3和鱸體表7幾乎不能生長。

表2不同溫度對3種真菌生長速率的影響

菌株編號1不同溫度下的生長速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鱸體表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鱸體表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鱸體表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值對3種真菌生長速率的影響由表3可以看出，不同pH值條件下不同真菌的生長速率不同：3種菌株在pH值為4～7時均能生長，鱸體表1和鱸體表7在pH值為5時生長最快，鱸體表3在pH值為6時生長最快，在其他pH值條件下生長速率有所下降?？傮w來說，分離到的3種菌

3討論

從患病鱸魚體表中共分離出7株真菌，根據菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7，根據分子鑒定結果和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定出鱸體表1屬于枝孢屬（Cladosporium），鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）。再結合形態(tài)學特征和顯微結構特點，進一步確定鱸體表1為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鱸體表3為變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鱸體表7為銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復雜，且少數形態(tài)特征和生理生化指標隨著環(huán)境的變

化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結果有一定偏差，增加了鑒定難度，今后可以嘗試用多種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，以求增加鑒定結果的可靠性。

對分離并鑒定的3種菌株進行生物學特性的初步研究，將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，發(fā)現毛霉生長的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長；低于10 ℃時枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長，而高于37 ℃對其生長影響不大。將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現分離到的3種菌株生長的最適pH值是中性偏酸性。

鱸魚體表常見的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些種類[6]。本研究從鱸魚體表的病害部位采集標本，共分離到7種菌株，根據肉眼觀察菌落形態(tài)進行取舍，在篩選出的3種菌株中沒有水霉，可能人為取舍時將水霉丟掉了，也可能是因培養(yǎng)基種類的原因而沒有分離到水霉。篩選出的3種菌株中，斑替枝孢霉在人體主要引起腦部的暗色絲孢霉病，肺部和皮膚感染較少見[7]，也沒有見到在魚體上分離到的報道。毛霉屬的某些種類能引起人類或其他動物患皮膚病，但變孢毛霉和銹色毛霉是否能引起鱸魚患皮膚病還有待于進一步確認。

參考文獻：

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