羅蕊+趙志強(qiáng)+黃鳳蘭等

摘要：本研究優(yōu)化了從蓖麻葉片中提取蛋白的過程，利用硫酸鹽沉淀法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法對蓖麻組培苗不同部位葉片中的毒蛋白的含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，蓖麻葉片中毒蛋白的含量與葉位呈正比。

關(guān)鍵詞：蓖麻；蓖麻毒蛋白；含量；葉位；硫酸鹽沉淀法

中圖分類號： S565.601文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0043-03

收稿日期：2013-05-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30760123、31060194）；國家民族事務(wù)委員會項(xiàng)目（編號：10NM02）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（編號：2010BS0511）；內(nèi)蒙古人才基金。

作者簡介：羅蕊（1988—），女，內(nèi)蒙古扎蘭屯人，碩士研究生，主要從事植物基因工程研究。E-mail：luorui19880629@163.com。

通信作者：陳永勝，博士，教授，主要從事植物基因工程研究工作。E-mail：chenys-2012@hotmail.com。蓖麻（Ricinus communis L.），大戟科，世界十大油料作物之一[1]，具有很高的應(yīng)用價值[2-5]。蓖麻中有毒的物質(zhì)主要包括蓖麻堿、蓖麻毒蛋白、變應(yīng)原、血球凝集素這4種物質(zhì)，都具有很大的毒性。蓖麻毒蛋白是一種蛋白分解酶，是由毒類素、全毒素、凝集素這3種物質(zhì)組成的蛋白質(zhì)[6]，其相對分子量為64 000左右，也有報(bào)道為36 000～85 000。蓖麻毒素（ricin）為白色粉末狀或結(jié)晶狀，無味，不溶于有機(jī)溶劑，在飽和的硫酸銨溶液中能沉淀析出。蓖麻毒蛋白由A、B 2條鏈組成。A鏈?zhǔn)切?yīng)鏈，是一種具有N-糖苷酶活性的多肽；B鏈有凝集素的活性，能與細(xì)胞上的半乳糖的糖蛋白結(jié)合[7]。蓖麻提取物具有殺蟲的特性，適用于開發(fā)生物農(nóng)藥。曾有人對蓖麻不同部位蓖麻堿的含量進(jìn)行測定[8]，但至今國內(nèi)還沒有人測定過蓖麻不同時期葉片中毒蛋白的含量。本試驗(yàn)采用硫酸銨沉淀法、BCA蛋白試劑盒法、UVwin5紫外軟件v5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法，對蓖麻毒蛋白在蓖麻不同部位葉片中含量進(jìn)行簡單、快速、精確的分析測定，為研究蓖麻毒蛋白在植株各部位的含量分析奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料為通蓖5號蓖麻組織培養(yǎng)苗，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蓖麻工程研究中心提供。

1.2儀器與試劑

Hema冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；紫外可見分光光度計(jì)-T6新世紀(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；BandScan蛋白定量分析軟件。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 蓖麻粗蛋白的提取參照曾佑煒等的方法[9]，對每1 g葉片中磷酸緩沖液的加入量和PEG的分子質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)化，同時對比冷藏葉片和新鮮葉片的提取效果，從而確定試驗(yàn)方法。取3株蓖麻組織培養(yǎng)苗，稱取約1 g蓖麻不同部位的葉片，在液氮中充分研磨；按照1 g葉片加入10 mL 5mmol/L磷酸緩沖液（PBS，pH值6.5，含100 mmol/L NaCl，稱為緩沖液A）的比例加入，并充分混勻；4 ℃放置過夜；4 ℃下17 000 r/min離心30 min，小心去除沉淀和白色脂肪；重復(fù)離心1次，取上清；在上清中加入固體（NH4）2SO4，達(dá)到60%飽和度；4 ℃放置 3 h；4 ℃下17 000 r/min離心30 min；倒去上清，把沉淀溶解在緩沖液A中；裝入透析袋（截留分子量：8 000～14 000），用PEG（分子量20 000）包埋后4 ℃透析3 h；4 ℃下 17 000 r/min 離心30 min，取上清即為毒蛋白粗品，記錄所得的粗蛋白的體積，并設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.2蓖麻粗蛋白含量的測定

1.3.2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的操作步驟參照北京莊盟國際生物基因科技有限公司BCA蛋白定量試劑盒說明，得到濃度計(jì)算公式：C=k1×D562 nm+k0，其中：k0=-0.080 91，k1=0.982 79，D562 nm為波長為562 nm處吸光度，相關(guān)性為0.999 7。

1.3.2.2粗蛋白濃度測定取一定量粗蛋白，稀釋100倍后測D562 nm，并根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算稀釋100倍后粗蛋白的濃度μg/μL）。粗蛋白濃度C（μg/μL）=（k1×稀釋100倍后的D562 nm+k0）×100。

1.3.2.3粗蛋白含量的計(jì)算根據(jù)粗蛋白的濃度、粗蛋白的體積和每個樣品中提取粗蛋白時葉片的重量，計(jì)算出每1 g葉片粗蛋白的含量。粗蛋白含量（mg）=稀釋100倍后濃度（μg/μL）×粗蛋白體積（mL）。1 g葉片粗蛋白含量（mg/g）=葉片中粗蛋白含量（mg）/葉片重量（g）。

1.3.3蓖麻毒蛋白含量的測定

1.3.3.1粗蛋白的SDS-PAGE電泳用12%的膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每個點(diǎn)樣孔上樣量為30 μL。

1.3.3.2蛋白條帶灰度比重分析具體操作步驟參見BandScan軟件操作說明。得到每個品種中每種蛋白質(zhì)占粗蛋白的灰度百分比。

1.3.3.3毒蛋白含量計(jì)算根據(jù)BandScan軟件分析毒蛋白占粗蛋白灰度百分比和每1 g葉片中粗蛋白含量，計(jì)算每1 g葉子中毒蛋白的含量。每1 g葉子中毒蛋白的含量（mg/g）=每1 g葉片粗蛋白含量（mg/g）×毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

利用BCA法繪制的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。從圖1可以看出，所制作的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量較好。

2.2蓖麻粗蛋白含量的測定

對3株蓖麻粗蛋白含量的測定結(jié)果見表1。

從表1可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳

3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近，在電泳圖中2條帶有重疊的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析軟件對3個植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析，得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每個葉片的條帶數(shù)不同，所以毒蛋白在分析時不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小，電泳過程中有些出現(xiàn)2條帶重疊現(xiàn)象，導(dǎo)致軟件分析時，被認(rèn)為是1條帶，但不影響軟件的最后分析結(jié)果。

對3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。

由表1和圖3可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量計(jì)算

對3株蓖麻中毒蛋白的含量計(jì)算結(jié)果見表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根據(jù)表1求出每個葉片中含有毒蛋白的平均含量，結(jié)果見表2。

由圖4可以看出，不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。

3結(jié)論與討論

從總體上看，蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。

蓖麻提取物中的主要?dú)⑾x物物質(zhì)為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿，蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用，蓖麻堿則主要具有觸殺胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農(nóng)藥具有很好的前景。在條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量，葉片在冷凍過程中毒蛋白會降解；老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量，隨著葉片中粗纖維的增加，蛋白質(zhì)總量減少，同時毒蛋白的含量也減少。

蓖麻籽主要用于榨油，經(jīng)高溫處理后，蓖麻中的主要毒性物質(zhì)只有變性原和蓖麻堿，餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田，利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對蓖麻的充分利用，減少資源浪費(fèi)，有助于開發(fā)新型生物農(nóng)藥，本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎(chǔ)，有利于農(nóng)藥開發(fā)的后續(xù)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張寶賢，譚德云，劉紅光，等. 我國蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其能源化利用的探討[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2010（1）：22-23.

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[4]張紅菊，趙懷勇. 蓖麻對鹽漬土的改良效果研究[J]. 中國水土保持，2010（7）：43-44，66.

[5]張智勇，陳永勝，倪娜，等. 蓖麻產(chǎn)品在農(nóng)藥中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2011（6）：74-76.

[6]趙青余，桂榮，那日蘇.蓖麻餅脫毒的研究進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè)，2002，23（11）：35-39.

[7]孫媚華，陳遷，宋光泉，等. 蓖麻毒蛋白的研究與應(yīng)用[J]. 廣東化工，2009，36（9）：144-145，162.

[8]溫燕梅，馮亞非，鄭明珠.蓖麻不同部位殺蟲活性成分蓖麻堿的提取及含量[J]. 農(nóng)藥，2008，47（8）：584-585，606.

[9]曾佑煒，宋光泉，彭永宏，等. 蓖麻毒蛋白的分離純化和毒理作用研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20（4）：23-25，32.

[10]趙建興，張樹懷，佘國珍，等. 蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，22（4）：78-80.

2.2蓖麻粗蛋白含量的測定

對3株蓖麻粗蛋白含量的測定結(jié)果見表1。

從表1可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳

3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近，在電泳圖中2條帶有重疊的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析軟件對3個植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析，得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每個葉片的條帶數(shù)不同，所以毒蛋白在分析時不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小，電泳過程中有些出現(xiàn)2條帶重疊現(xiàn)象，導(dǎo)致軟件分析時，被認(rèn)為是1條帶，但不影響軟件的最后分析結(jié)果。

對3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。

由表1和圖3可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量計(jì)算

對3株蓖麻中毒蛋白的含量計(jì)算結(jié)果見表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根據(jù)表1求出每個葉片中含有毒蛋白的平均含量，結(jié)果見表2。

由圖4可以看出，不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。

3結(jié)論與討論

從總體上看，蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。

蓖麻提取物中的主要?dú)⑾x物物質(zhì)為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿，蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用，蓖麻堿則主要具有觸殺胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農(nóng)藥具有很好的前景。在條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量，葉片在冷凍過程中毒蛋白會降解；老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量，隨著葉片中粗纖維的增加，蛋白質(zhì)總量減少，同時毒蛋白的含量也減少。

蓖麻籽主要用于榨油，經(jīng)高溫處理后，蓖麻中的主要毒性物質(zhì)只有變性原和蓖麻堿，餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田，利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對蓖麻的充分利用，減少資源浪費(fèi)，有助于開發(fā)新型生物農(nóng)藥，本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎(chǔ)，有利于農(nóng)藥開發(fā)的后續(xù)研究。

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[10]趙建興，張樹懷，佘國珍，等. 蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，22（4）：78-80.

2.2蓖麻粗蛋白含量的測定

對3株蓖麻粗蛋白含量的測定結(jié)果見表1。

從表1可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋

2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳

3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近，在電泳圖中2條帶有重疊的部分。

2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析

BandScan蛋白定量分析軟件對3個植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析，得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比，由于每個葉片的條帶數(shù)不同，所以毒蛋白在分析時不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小，電泳過程中有些出現(xiàn)2條帶重疊現(xiàn)象，導(dǎo)致軟件分析時，被認(rèn)為是1條帶，但不影響軟件的最后分析結(jié)果。

對3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。

由表1和圖3可以看出：第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。

2.5毒蛋白含量計(jì)算

對3株蓖麻中毒蛋白的含量計(jì)算結(jié)果見表1。

由表1可以看出，第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g；第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、

0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g；第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。

根據(jù)表1求出每個葉片中含有毒蛋白的平均含量，結(jié)果見表2。

由圖4可以看出，不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。

3結(jié)論與討論

從總體上看，蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。

蓖麻提取物中的主要?dú)⑾x物物質(zhì)為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿，蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用，蓖麻堿則主要具有觸殺胃

毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農(nóng)藥具有很好的前景。在條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量，葉片在冷凍過程中毒蛋白會降解；老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量，隨著葉片中粗纖維的增加，蛋白質(zhì)總量減少，同時毒蛋白的含量也減少。

蓖麻籽主要用于榨油，經(jīng)高溫處理后，蓖麻中的主要毒性物質(zhì)只有變性原和蓖麻堿，餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田，利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對蓖麻的充分利用，減少資源浪費(fèi)，有助于開發(fā)新型生物農(nóng)藥，本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎(chǔ)，有利于農(nóng)藥開發(fā)的后續(xù)研究。

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