摘要：擬南芥與水稻是植物基因組中的模式生物，植物的基因功能及基因結(jié)構(gòu)間的相關(guān)聯(lián)系一直是研究的重點(diǎn)，通過對這2種模式生物進(jìn)行基因敲除來確定基因功能是目前對植物基因研究最為普遍的做法。目前，關(guān)于基因功能突變體的數(shù)據(jù)資源的介紹并不充分，針對這種情況，本文介紹了基因功能研究的大規(guī)模隨機(jī)敲除突變的常見載體標(biāo)簽及其方法，并給出了與其相應(yīng)的相關(guān)數(shù)據(jù)庫的介紹。

關(guān)鍵詞：基因敲除；數(shù)據(jù)庫；模式生物；標(biāo)簽

中圖分類號： Q754文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0039-04

收稿日期：2013-07-18

作者簡介：潘曉寒（1988—），女，江蘇宜興人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镞M(jìn)化。E-mail：huajianji00@163.com。目前，基因研究已逐漸由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)領(lǐng)域展開。擬南芥和水稻作為模式生物，在植物中率先展開基因功能的研究[1]。目前，對基因功能的研究方法有許多種，而建立敲除突變體庫是最常見的方法[2]。基因敲除是指用方法使植物基因失活，然后通過觀察表型來確定基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。最初，γ射線、化學(xué)誘變劑EMS等物理化學(xué)誘變方法被用來制作突變體[3]，之后同源重組[4]、基因沉默、RNA干擾[5]等方法也被用來制作突變體，但這些方法都不足以在多細(xì)胞生物體中構(gòu)建能夠包含所有基因的突變體庫。自農(nóng)桿菌在單子葉植物中的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得成功后，利用外源序列對植物基因組的大規(guī)模插入來構(gòu)建突變體庫成為最常用也是最可靠的辦法[6-7]。根據(jù)插入元件的不同，大規(guī)模外源基因的插入建立的突變體庫可以大致分為3種：T-DNA插入構(gòu)建的突變體庫[8-9]、轉(zhuǎn)座子插入構(gòu)建的突變體庫[10-11]以及反轉(zhuǎn)座子插入構(gòu)建的突變體庫[12-13]。目前在全世界范圍內(nèi)已建立了大量的上述3種元件作為突變工具的水稻和擬南芥的突變數(shù)據(jù)[14-15]。

隨著研究深入，更多的突變體庫在全世界范圍內(nèi)建立起來[16]，在擬南芥中更是實(shí)現(xiàn)了幾乎全部基因都有敲除突變的高覆蓋率[2]。在其他植物（如玉米、馬鈴薯、小麥、苜蓿等）中也都有插入突變數(shù)據(jù)庫的存在[17-19]，不過數(shù)據(jù)尚不夠充分。本文介紹了一些重要的擬南芥和水稻突變體庫目前的規(guī)模和制造突變株的方法，為需要突變株種子以及數(shù)據(jù)的學(xué)者提供方便。

1大規(guī)模外源基因插入構(gòu)建突變體庫的幾種常用方法

1.1T-DNA插入構(gòu)建突變體庫

T-DNA突變體庫的建立首先需要制作載體Ti質(zhì)粒?？剐曰虮徽先胼d體，然后導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。取植物的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，將繼代培養(yǎng)的植物愈傷組織放入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液之中，使其感染農(nóng)桿菌，最后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。在進(jìn)行完2次選擇培養(yǎng)后，將長出的抗性愈傷組織通過組織分化形成植株，對植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測來確?；蚯贸ぷ鞯耐瓿?。提取植物DNA，用TAIL-PCR等方法得到旁鄰序列，測序比對全基因組序列得到T-DNA插入的具體位置[20]。

1.2轉(zhuǎn)座子插入構(gòu)建突變體庫

轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)分為一元系統(tǒng)和雙元系統(tǒng)2種。雙元系統(tǒng)是將Ac轉(zhuǎn)座子和Ds轉(zhuǎn)座子分別插入到2個(gè)T-DNA載體之中[21]，侵染植株，讓2種植株雜交得到F1代，又通過自交得到F2代，在F2代中對Ac轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行篩選。為了穩(wěn)定Ds的插入位置使其不再轉(zhuǎn)移，需要對Ac轉(zhuǎn)座子的存在進(jìn)行排除。一元系統(tǒng)簡化了雙元系統(tǒng)，同時(shí)將Ac的轉(zhuǎn)座酶編碼序列和Ds轉(zhuǎn)座子載入一個(gè)T-DNA載體上，通過轉(zhuǎn)座酶的存在使Ds跳躍移位。因此在第一代中就能得到Ds跳躍的植株[22-23]。當(dāng)Ds轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移出原插入位點(diǎn)后，則可以通過篩選將轉(zhuǎn)座酶基因去除，得到穩(wěn)定遺傳突變株。目前作為轉(zhuǎn)座子插入的轉(zhuǎn)座子有玉米轉(zhuǎn)座子Ac/Ds、En/Spm以及金魚草轉(zhuǎn)座子Tam3。

1.3反轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入法

1999年，Sato等利用水稻逆轉(zhuǎn)座子Tos17基因敲除體系分離了6個(gè)水稻knl-型同源異型框基因，發(fā)現(xiàn)了水稻矮化突變基因OSH15。Tos17從此成為植物基因水稻中的一個(gè)內(nèi)源反轉(zhuǎn)座子突變載體[24]，主要被用來在水稻中進(jìn)行突變體數(shù)據(jù)庫的研究[25]。Tos17在自然條件下約有4個(gè)拷貝數(shù)，在組培的條件下激活，可有5～30個(gè)拷貝數(shù)插入，分化成植株后就失活，因此Tos17插入引起的突變可以穩(wěn)定遺傳[26]。Tos17的拷貝數(shù)隨著組織培養(yǎng)時(shí)間延長而增多，可以通過控制組織培養(yǎng)時(shí)間來控制轉(zhuǎn)座的拷貝數(shù)[27]。

2相關(guān)植物突變數(shù)據(jù)庫的介紹

2.1擬南芥突變數(shù)據(jù)庫

下面分別介紹了水稻和擬南芥的一些常用的重要突變數(shù)據(jù)庫，表1列出了質(zhì)粒中所存在的各種元件及其作用。

縮寫名稱作用19S CaMV Pro花椰菜花葉病毒19S啟動子35S CaMV Pro花椰菜花葉病毒35S啟動子Amp氨芐青霉素抗性基因F1 oriF1噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)GAL4/VP16酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4基因/單純皰疹病毒蛋白VP16蛋白基因GFP綠色熒光蛋白基因GUS轉(zhuǎn)β-葡糖醛酸酶基因Hph潮霉素抗性基因aph（4）-IaHyg潮霉素抗性基因aph（4）-IbI2水稻α微管A1基因第二內(nèi)含子MAS Pro甘露堿合成酶雙向啟動子Nos pro農(nóng)桿菌胭脂堿啟動子Nos Ter農(nóng)桿菌胭脂堿終止子NptⅡ新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗卡那霉素基因OsTubA1水稻α微管A1基因OsTubA1 Pro水稻α微管A1基因啟動子OsTubA1 Ter水稻α微管A1基因終止子ployAployA尾巴pUC oripUC質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)pUC18 patial sequencepUC18質(zhì)粒部分序列Sul1磺胺藥物抗性基因

2.1.1SALK T-DNA 數(shù)據(jù)庫SALK實(shí)驗(yàn)室是目前用 T-DNA 插入的方法建立的擬南芥基因組插入突變數(shù)據(jù)庫中突變最為可觀的實(shí)驗(yàn)室。數(shù)據(jù)庫使用傳統(tǒng)的T-DNA載體，對擬南芥生態(tài)型col進(jìn)行基因敲除工作。目前完成137 259個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，敲除擬南芥96%以上基因。這個(gè)插入數(shù)目在擬南芥中已經(jīng)接近飽和[2]。SALK實(shí)驗(yàn)室使用的質(zhì)粒載體是pROK2，這是一個(gè)由pBIN19改良后的質(zhì)粒，擁有卡那霉素抗性基因[28]。圖1給出了SALK實(shí)驗(yàn)室的載體結(jié)構(gòu)。

2.1.2RATM（Riken）Ac/Ds轉(zhuǎn)座子敲除數(shù)據(jù)庫RATM數(shù)據(jù)庫是一個(gè)采用Ds轉(zhuǎn)座子對擬南芥進(jìn)行基因敲除的數(shù)據(jù)庫[29]。這個(gè)基因敲除數(shù)據(jù)庫已有17 671個(gè)突變株。突變體庫采用雙元載體的方法，將含有Ac轉(zhuǎn)座酶序列的T-DNA插入突變株與含有Ds轉(zhuǎn)座子的T-DNA插入突變株雜交，得到突變株種子，然后對種子進(jìn)行植株培養(yǎng)，再自交對種子進(jìn)行篩選，剔除那些含有Ac轉(zhuǎn)座酶的不穩(wěn)定植株。圖2給出了RTAM轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)。

2.1.3GABI-Kat T-DNA數(shù)據(jù)庫GABI-Kat數(shù)據(jù)庫是一個(gè)使用T-DNA對擬南芥生態(tài)型col-0進(jìn)行基因敲除的數(shù)據(jù)庫，在T-DNA插入數(shù)據(jù)庫數(shù)目僅次于SALK T-DNA 數(shù)據(jù)庫。目前已有130 000條側(cè)翼序列標(biāo)簽以及70 578左右的突變株系。其中被敲除的基因數(shù)量達(dá)62.5%[30]。質(zhì)粒是pAC161、pADIS1、pAC160和pGABI1[31]，通過加入增強(qiáng)子作為激活標(biāo)簽。F1代抗性植株的種子在F2代時(shí)可能會丟失插入的T-DNA，因此所有的二代種都必須經(jīng)過檢驗(yàn)確定 T-DNA 插入。目前這個(gè)數(shù)據(jù)庫的T-DNA保留率在78%左右[32]。圖3給出了GABI-Kat載體pAC161的結(jié)構(gòu)。

2.2水稻突變數(shù)據(jù)庫

2.2.1POSTECH RISD T-DNA數(shù)據(jù)庫RISD數(shù)據(jù)庫是由韓國postech中心植物功能基因組實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的以傳統(tǒng)的 T-DNA 為載體的數(shù)據(jù)庫， 大約有47 932個(gè)T-DNA插入突

變株[33-34]。另外在T-DNA的插入過程中，需通過組培的階段，因而產(chǎn)生反轉(zhuǎn)座子Tos17的新插入，生成一部分新的突變株。使用的載體有pGA2707、pGA2717以及激活標(biāo)簽載體pGA2715、pGA2772[35]。圖4給出postech實(shí)驗(yàn)室T-DNA載體pGA2707的結(jié)構(gòu)。

2.2.2SHIP T-DNA數(shù)據(jù)庫SHIP數(shù)據(jù)庫是中國科學(xué)院上海植物生態(tài)生理研究所建立的T-DNA插入突變體庫，以水稻粳稻中花11作為受體品種。對插入到基因的突變株植株進(jìn)行分離，使用的質(zhì)粒為pSMR-J18R，這是水稻基因突變研究較常見的載體，少數(shù)植株采用質(zhì)粒pCAMBIA1301[36]。圖5給出SHIP實(shí)驗(yàn)室T-DNA載體pSMR-J18R的結(jié)構(gòu)。

2.2.3RTIM Tos17突變數(shù)據(jù)庫RTIM數(shù)據(jù)庫由日本農(nóng)業(yè)資源研究所（NIAS）開展構(gòu)建，采用的水稻株系是粳稻品種日本晴[37]。該數(shù)據(jù)庫利用Tos17反轉(zhuǎn)座子來制造突變數(shù)據(jù)庫[38]，突變株中反轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)數(shù)量較高，通常每個(gè)突變株都帶有10～12個(gè)反轉(zhuǎn)座子插入。

3植物突變數(shù)據(jù)庫的研究前景

基因功能的研究繼基因結(jié)構(gòu)研究之后對生物自身信息進(jìn)一步解密，直接關(guān)系到生物表型和遺傳信息之間的聯(lián)系，因此尤為被關(guān)注。目前，植物基因功能研究正如火如荼地展開，單個(gè)基因進(jìn)行敲除后進(jìn)行培育獲得的穩(wěn)定遺傳的純和突變株系為后續(xù)展開的基因功能的研究提供了很好的研究模型。例如，在植物信號傳導(dǎo)、抗逆性研究上突變株起到了不可替代的作用。此外，基因功能獲得突變株也和功能缺失突變株系一樣在研究中得到重視。本文介紹的這些數(shù)據(jù)庫大部分都提供突變株種子，以滿足研究者們對基因功能研究的需要。

隨著模式生物基因組研究的深入，各種非模式生物的基因組研究也開始進(jìn)行。同一個(gè)基因結(jié)構(gòu)在不同植物是否擁有相同的功能，基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化的同時(shí)是否帶入了功能的演變，基因在不斷進(jìn)化分化的同時(shí)，功能又受到怎樣的影響，基因數(shù)量的演變與功能的存在有何關(guān)系，都是在植物功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步完善后所需解決的問題。另外，載體的構(gòu)建及抗性基因的篩選等步驟，都將在未來進(jìn)一步精簡，更多的為了專門的研究而提出的新方法也將陸續(xù)出現(xiàn)。

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