田 晨 趙宗江 張新雪 張豐豐 程明秀 王穎超 趙 敬 吳志奎

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與生化實驗室，北京，100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京，100053)

補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細(xì)胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響

田 晨1趙宗江1張新雪1張豐豐1程明秀1王穎超1趙 敬1吳志奎2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與生化實驗室，北京，100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京，100053)

目的：探討補(bǔ)腎益髓生血法再生障礙性貧血(Aplastic Anemia，AA，簡稱再障)大鼠含藥血清對大鼠骨髓造血干細(xì)胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響。方法：在前期整體動物實驗的基礎(chǔ)上，體外培養(yǎng)正常大鼠造血干細(xì)胞，誘導(dǎo)其定向紅系分化，分為空白對照組、正常對照組、模型組、司坦唑醇組(康力龍組)、益髓生血組、溫腎生血組和滋腎生血組，在培養(yǎng)體系中加入含藥血清干預(yù)4d后，提取紅系細(xì)胞總RNA及蛋白，分別采用RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與正常對照組相比，模型組細(xì)胞JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，各治療組JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01或P<0.05)；滋腎生血組JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達(dá)高于益髓生血組和溫腎生血組(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)腎益髓生血法能夠增強(qiáng)JAK2、STAT5的表達(dá)，可能通過影響JAK2/STAT5信號通路來促進(jìn)紅系細(xì)胞的分化成熟，其中滋腎生血法優(yōu)于益髓生血法和溫腎生血法。

補(bǔ)腎益髓生血法；再障；造血干細(xì)胞；紅系分化；JAK2/STAT5信號通路

再生障礙性貧血(Aplastic Anemia，AA，簡稱再障)是骨髓造血功能衰竭性疾病，臨床癥狀以貧血、出血、感染為主。屬于中醫(yī)“血虛”“髓勞”等范疇，其基本病機(jī)在于腎虛，腎不藏精，生髓，化血[1]，貧血的發(fā)生主要是由于紅系發(fā)育異常，導(dǎo)致成熟紅細(xì)胞減少，血紅蛋白濃度降低。EPO是促進(jìn)紅細(xì)胞分化成熟最為主要的細(xì)胞因子，EPO與紅系祖細(xì)胞表面的EPOR結(jié)合后，可以啟動JAK2/STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或抑制，最終導(dǎo)致紅系細(xì)胞的增殖和分化[2]。補(bǔ)腎益髓生血法是針對AA的基本病機(jī)，根據(jù)中醫(yī)“腎藏精，生髓化血”理論結(jié)合臨床實踐確立的治療AA大法。該法可以明顯改善患者的貧血癥狀[3]，增加紅系祖細(xì)胞數(shù)目[4]，提升紅細(xì)胞水平，但其作用機(jī)制的研究有待進(jìn)一步研究，因此，本研究在前期整體動物實驗的基礎(chǔ)上，體外培養(yǎng)造血干細(xì)胞并誘導(dǎo)其向紅系分化，觀察補(bǔ)腎益髓生血法再障大鼠含藥血清對正常大鼠骨髓造血干細(xì)胞紅系分化過程中JAK2/STAT5信號通路的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞 正常大鼠骨髓單個核細(xì)胞，SD大鼠，體重(200±20)g。

1.2 主要試劑 IMDM(Gibco，批號：12200036)，大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋，批號：LTS1083)，干細(xì)胞因子(SCF，PeproTech，批號：0110258)，重組大鼠白細(xì)胞介素3(IL-3，PROSPEC，批號：1108RIL301)，重組人促紅細(xì)胞生成素(EPO，賽博爾，批號：201206042)，兔單克隆抗體JAK2(Cell Signaling Technology，批號：D2E12)，兔多克隆抗體STAT5(abcam，批號：ab68465)，β-acting單克隆抗體(Cell Signaling Technology，批號：4970)，山羊抗兔IgG HPR(康為世紀(jì)，批號：CW0103)，甲叉丙烯酰胺(Ameresco，批號：2967B040)，甲叉雙丙烯酰胺(Ameresco，批號：1209B293)，cDNA第一鏈合成試劑盒(promega，A3500，批號：0000073779)，Go Taq○RGreen Mix(promega，批號：0000040423)，JAK2、STAT5、GAPDH、β-actin引物合成于生工生物有限公司。

1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，超凈工作臺(北京市昌平長城空氣凈化設(shè)備公司)，恒溫CO2培養(yǎng)箱(編號：B5060EK/CO2，德國產(chǎn))，0.22 μm濾器(PALL，批號：1419267)，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(COSTAR，批號：3524)，電泳槽，ICMIAS系列多功能圖像分析系統(tǒng)，電源(Bio-Rad，041BR111842)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備及處理 使用整體動物實驗結(jié)束時分離的各組大鼠血清[5]。股動脈取血，靜置2 h后，2 500 r/min低溫離心20 min，抽取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用前將其置? ℃24 h融化，室溫復(fù)溫1 h后，于56 ℃水浴鍋中滅活補(bǔ)體30 min，0.22 μm的濾器過濾后分裝備用，-20 ℃保存。

2.2 大鼠骨髓單個核細(xì)胞離培養(yǎng)與分組 取正常SD大鼠后股骨段骨髓，用PBS溶液反復(fù)沖洗3次，將得到的細(xì)胞懸液緩慢的加入到等量淋巴細(xì)胞分離液上層，2 500 r/min離心25 min；輕輕抽取中間白膜層骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)，加入10%FBS IMDM洗滌2次，然后用10%FBS IMDM重懸，計數(shù)后，調(diào)整BMMNC濃度為1×106/mL。于含有1%甲基纖維素、IMDM，10%FBS、1%BSA、1×10-4M β-巰基乙醇、SCF 50ng/mL、IL-3 10ng/mL、EPO 3U/mL、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的紅系培養(yǎng)體系培養(yǎng)，分別加入各個組別的含藥血清，占培養(yǎng)體系比例為20%，BMMNC密度為1×105/mL，每孔1 mL，24孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，周圍孔加入0.5 mL無菌超純水，將細(xì)胞板置于5%CO2、37 ℃、保持濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)。

根據(jù)加入含藥血清的不同，分為空白對照組(30%FBS組，不含大鼠血清)、正常對照組、模型組、西藥對照司坦唑醇組(康力龍組)、益髓生血組、溫腎生血組、滋腎生血組。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，于第4天提取細(xì)胞總RNA及蛋白。

2.3 檢測指標(biāo)及檢測方法 分別采用RT-PCR和Western blot方法檢測各組紅系細(xì)胞中JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達(dá)，JAK2、STAT5、GAPDH、β-actin引物見表1。

表1 基因引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細(xì)胞JAK2、STAT5mRNA表達(dá)的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與康力龍組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與益髓生血組相比，□P<0.05，□□P<0.01；與溫腎生血組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細(xì)胞紅系分化JAK2、STAT5mRNA表達(dá)的影響 與正常對照組相比，模型組JAK2、STAT5mRNA表達(dá)明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與模型組相比，各治療組JAK2、STAT5mRNA表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，滋腎生血組JAK2、STAT5mRNA表達(dá)高于益髓生血組和溫腎生血組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。具體見表2，圖1-圖2。

圖1 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細(xì)胞JAK2、STAT5mRNA的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與康力龍組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與益髓生血組相比，□P<0.05，□□P<0.01；與溫腎生血組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

圖2 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細(xì)胞JAK2、STAT5mRNA表達(dá)的影響

注：1空白對照組；2正常對照組；3模型組；4康立龍組；5益髓生血組；6溫腎生血組；7滋腎生血組。

表3 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對JAK2、STAT5蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與康力龍組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與益髓生血組相比，□P<0.05，□□P<0.01；與溫腎生血組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3.2 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細(xì)胞紅系分化JAK2、STAT5蛋白表達(dá)的影響 模型組JAK2、STAT5蛋白表達(dá)較正常對照組明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，各治療組JAK2、STAT5蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01或P<0.05)，滋腎生血組JAK2、STAT5蛋白表達(dá)明顯高于益髓生血組(P<0.01)、滋腎生血組JAK2蛋白表達(dá)明顯高于溫腎生血組(P<0.05)。具體見表3，圖3-圖4。

圖3 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對JAK2、STAT5蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與康力龍組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與益髓生血組相比，□P<0.05，□□P<0.01；與溫腎生血組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

圖4 補(bǔ)腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細(xì)胞JAK2、STAT5蛋白表達(dá)的影響

注：1空白對照組；2正常對照組；3模型組；4康立龍組；5益髓生血組；6溫腎生血組；7滋腎生血組。

4 討論

AA是常見的血液系統(tǒng)疾病之一，以外周血全血細(xì)胞減少為主要特征。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血液的化生與腎藏精密切相關(guān)，而AA主要表現(xiàn)出貧血等癥狀，故腎虛，腎不藏精，生髓不足是AA發(fā)病的關(guān)鍵病機(jī)。血液的化生離不開五臟協(xié)調(diào)，但與腎最為密切。《張氏醫(yī)通》云：“氣不耗，歸精于腎化為精，精不泄，歸精于肝而化清血”，《靈樞·決氣》云：“中焦受氣取汁，變化而赤是謂血”，指出腎與肝、脾胃同化；《醫(yī)精經(jīng)義》曰：“腎藏精，精生髓，髓生骨……精足則髓足”，《血證論》云：“氣乃先天腎中一點腎陽，靜而復(fù)動，化生精血”，指出了腎、精、骨、髓、血的關(guān)系，反映了精髓化生血液主要取決于腎的功能。目前大多醫(yī)家認(rèn)為治療AA基本上都是在“以腎為本、從腎論治”的基礎(chǔ)上進(jìn)行變通，充分發(fā)揮中醫(yī)辨證論治AA的優(yōu)勢。

AA患者全血細(xì)胞的減少主要源于T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常導(dǎo)致造血干細(xì)胞向各系細(xì)胞分化過程中出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致各系成熟血細(xì)胞減少[9-10]。而紅系發(fā)育異常，導(dǎo)致成熟紅細(xì)胞減少，血紅蛋白濃度降低是AA患者出現(xiàn)貧血癥狀的主要機(jī)制，調(diào)控紅系分化成熟的信號通路主要有JAK/STAT通路、Ras/MAPK通路和PI3K通路，其中，JAK2/STAT5信號通路與EPOR信息傳遞關(guān)系最為密切[11-12]?；罨腟TAT5在EPO介導(dǎo)的紅系細(xì)胞分化成熟過程中是必要的，抑制STAT5活化后，紅細(xì)胞的成熟受抑制[2]，STAT5可通過JAK2/STAT5信號通路來調(diào)節(jié)紅系關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)激活紅系特異基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)紅系細(xì)胞分化、成熟。在紅系分化過程中，EPOR基因的表達(dá)依賴于GATA-l活性。GATA-1-miRNA軸在紅細(xì)胞生成中發(fā)揮重要作用，GATA-1可通過miRNA途徑來調(diào)控紅細(xì)胞分化成熟，已報道m(xù)iR-27a/24、microRNA-23a、miR-199b-5p能夠促進(jìn)紅系生成[13-15]。研究表明，造血干細(xì)胞向紅系分化過程中，紅系分化相關(guān)基因GATA-1、Klf1、EPOR表達(dá)明顯升高，而且多向分化祖細(xì)胞MPP顯示出JAK2異常信號，提示JAK2信號能夠影響造血干/祖細(xì)胞定向紅系分化[16]。

補(bǔ)腎益髓生血法組方以“腎藏精”為理論指導(dǎo)，包括益髓生血方(益髓生血顆粒)、溫腎生血方、滋腎生血方三方。其代表方益髓生血顆粒以山茱萸、何首烏滋陰補(bǔ)腎共為君藥，以熟地黃、補(bǔ)骨脂助君生精化血、炙黃芪、黨參健脾益氣、阿膠、當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)血共為臣藥，雞血藤、鱉甲活血化瘀為佐藥，砂仁為使藥，以防滋膩，全方補(bǔ)腎為主，兼以健脾養(yǎng)肝，共奏滋腎養(yǎng)陰、益髓生血、健脾益氣之功。溫腎生血方在益髓生血顆粒的基礎(chǔ)上加入淫羊藿，以增強(qiáng)溫腎陽之功。滋腎生血方在益髓生血顆粒的基礎(chǔ)上入女貞子，以加強(qiáng)滋腎陰、壯髓生血功效。

課題組通過前期實驗研究證明了補(bǔ)腎益髓生血法對AA大鼠具有肯定的療效。補(bǔ)腎益髓生血法可以改善AA大鼠的一般狀態(tài)，增加AA大鼠體重，使外周血全血細(xì)胞增加，使血細(xì)胞形態(tài)趨于正常，增加骨髓有核細(xì)胞數(shù)，減少脂肪滴，調(diào)節(jié)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的異常，促進(jìn)造血祖細(xì)胞的增殖分化，增加造血祖細(xì)胞CFU-E、BFU-E和CFU-GM的數(shù)量，提升造血干細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、PU.1的表達(dá)，從而促進(jìn)血細(xì)胞的成熟，起到恢復(fù)AA骨髓造血的作用，并且對比研究益髓生血法、溫腎生血法和滋腎生血法，結(jié)果顯示滋腎生血法對AA大鼠貧血狀態(tài)、造血功能、免疫調(diào)節(jié)、造血祖細(xì)胞增殖分化等各個方面的改善作用優(yōu)于益髓生血法和溫腎生血法[4-5]。本研究從紅系分化關(guān)鍵的JAK2/STAT5信號通路角度入手，探討補(bǔ)腎益髓生血法調(diào)控AA造血干細(xì)胞定向紅系分化成熟的作用機(jī)制。

研究結(jié)果表明，在EPO誘導(dǎo)造血干細(xì)胞向紅系分化過程中，加入AA大鼠血清及各治療組含藥血清干預(yù)后，模型組紅系細(xì)胞JAK2、STAT5 mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于正常對照組，各治療組紅系細(xì)胞JAK2、STAT5 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于模型組，且滋腎生血組JAK2、STAT5 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于益髓生血組、溫腎生血組。說明補(bǔ)腎益髓生血法能夠影響JAK2/STAT5信號通路，增強(qiáng)JAK2、STAT5的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游相關(guān)靶基因，促進(jìn)紅系細(xì)胞的分化成熟，提示補(bǔ)腎益髓生血法可能通過影響JAK2/STAT5信號通路來促進(jìn)紅系細(xì)胞分化成熟，從而達(dá)到治療AA的作用。對比三法，滋腎生血法對JAK2/STAT5調(diào)控作用最強(qiáng)，可能是由于腎精虧虛、血化無源是AA全血細(xì)胞減少的根本原因，滋腎生血方加入滋補(bǔ)肝腎之陰的女貞子，在益髓生血方基礎(chǔ)上增強(qiáng)了滋陰、壯髓、生血的功效，與AA病機(jī)更加切合，從而表現(xiàn)出較好的促進(jìn)紅系造血作用。本研究闡明了補(bǔ)腎益髓生血法促進(jìn)造血干細(xì)胞紅系分化成熟的分子機(jī)制及三法的作用特點，為深入闡明補(bǔ)腎益髓生血法治療AA療效機(jī)制提供了實驗依據(jù)，為中醫(yī)“腎藏精、生髓化血”理論研究及臨床應(yīng)用提供了有力的實驗依據(jù)。

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(2014-04-28收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effect of Tonifying Kidney，Benefiting Marrow and Engendering Blood Method Medicated Serum of Rats with Aplastic Anemia on JAK2/STAT5 Signaling Pathway in The Erythroid Differentiation of Hematopoietic Stem Cells

Tian Chen1，Zhao Zongjiang1，Zhang Xinxue1，Zhang Fengfeng1，Cheng Minxiu1，Zhao Jing1，Wang Yingchao1，Wu Zhikui2

(1 Cellular and Biochemical Laboratory of Basic Medical College，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Guang'anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective：To investigate the effect of tonifying kidney，benefiting marrow and engendering blood method on JAK2/STAT5 signaling pathway in the erythroid differentiation of hematopoietic stem cells. Methods： On the basis of the previous in vivo animal experiment，the hematopoietic stem cells were cultivated with AA rats serum and induced erythroid differentiation in vitro. The cells were divided into the following seven groups： blank control group，normal control group，model group，stanozolol group，benefiting marrow and engendering blood group，warming kidney and engendering blood group，nourishing kidney and engendering blood group. Erythroid cells RNA and protein were extracted in 4 days respectively，and the level of JAK2，STAT5 mRNA and protein in erythroid cells were detected with RT-PCR and Western blot. Results： Compared with the normal control group，the expressing of JAK2，STAT5 mRNA and protein in cells decreased significantly in the model group(P<0.01).Compared with the model group，the expression of JAK2，STAT5 mRNA and protein both significantly increased in treatment groups(P<0.01 orP<0.05)，while the nourishing kidney group was significantly better than the benefiting marrow group and warming kidney group of the expression of JAK2，STAT5mRNA and protein. Conclusion： The method of tonifying kidney，benefiting marrow and engendering blood can increase the expression of JAK2，STAT5 and promote erythroid differentiation and maturation by affecting JAK2/STAT5 signaling pathway and stimulating activity. The nourishing kidney and engendering blood method is better than benefiting marrow and warming kidney method.

Tonifying kidney，benefiting marrow and engendering blood mthod; Aplastic anemia; Hematopoietic stem cells; Erythroid differentiation; JAK2/STAT5 signaling pathway

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)——基于“腎藏精”的臟象理論基礎(chǔ)研究——從障礙性貧血探討“腎生髓”理論的研究(課題編號：2010CB530406)

田晨，女，研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治再生障礙性貧血，E-mail：tianchen0901@163.com

趙宗江，男，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，郵編：100029，電話：(010)64286988，E-mail：zongjiangz@sina.com

R556.5;R242;R392.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.06.008