凌人，凌今，倪型灝，薛洪燕，施紅旗，陳仲華

（1.金華廣福腫瘤醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321001；2.復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203；3.浙江省腫瘤醫(yī)院 病理科，浙江 杭州 310001；4.金華市人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321001；5.金華市中心醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321001）

乳腺癌是一種遺傳異質(zhì)性的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的過程，往往涉及多個(gè)基因的改變[1]。以腫瘤生物學(xué)指標(biāo)（包括ER、PR、HER2等）為依據(jù)的基因分型，不僅能夠判斷腫瘤的預(yù)后及轉(zhuǎn)移，還能預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療的敏感性，并為腫瘤個(gè)體化治療提供依據(jù)[2-3]。然而，乳腺癌相關(guān)的癌基因遠(yuǎn)不止這些，本研究通過對(duì)前期篩查與乳腺癌相關(guān)的4個(gè)新基因—RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706在乳腺癌中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)、分析，旨在探討這4個(gè)基因與乳腺癌臨床特征的關(guān)系，為臨床診治提供新的參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 標(biāo)本取自2008年1月-2011年12月間在金華廣福腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的60例乳腺癌患者，均為女性，中位年齡53歲（38～82歲），術(shù)前均未做放化療以及內(nèi)分泌治療，有完整的臨床資料。研究對(duì)象確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，參照WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類，術(shù)后根據(jù)患者臨床分期、病理分型進(jìn)行化療及輔助內(nèi)分泌治療，對(duì)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且直徑5 cm以上者予以放療。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706一抗以及對(duì)應(yīng)二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司?？贵w稀釋工作液、DAB顯色試劑盒購(gòu)自Leica公司。免疫組織化學(xué)全自動(dòng)染色儀為L(zhǎng)eica公司的BOND-MAX。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本：取上述存檔的石蠟包埋組織塊，連續(xù)切片，每份標(biāo)本行常規(guī)HE染色對(duì)照。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色：采用S-P法[4]，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的條件進(jìn)行染色。石蠟組織切片脫蠟、水化后滅活內(nèi)源性過氧化物酶，其中RCL、ZNF706組切片高壓抗原熱修復(fù)1 min，TAOK1、14-3-3 zeta組切片不修復(fù)，PBS溶液清洗，10%正常羊血清封閉30 min，傾去血清再滴加一抗（稀釋度：RCL 1∶100，TAOK1 1∶200，14-3-3 zeta 1∶100，ZNF706 1∶200）室溫下孵育120 min，二抗室溫下孵育30 min，加入顯色液顯色。蘇木素復(fù)染、脫水、分色、透明、中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)染色由Leica全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀完成。

1.3.3 質(zhì)量控制：①做好預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳免疫組織化學(xué)條件。②對(duì)照設(shè)置：以說明書指定的組織切片染色陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，以普通羊血清代替一抗為陰性對(duì)照。③判定程序：連續(xù)10個(gè)高倍鏡視野下分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀察各抗體的細(xì)胞定位，以定位處出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為陽(yáng)性表現(xiàn)，觀察染色強(qiáng)度并計(jì)數(shù)染色比例。④免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀由2位病理科主治以上級(jí)別醫(yī)師在雙盲條件下獨(dú)立完成，判讀不一致時(shí)，經(jīng)多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結(jié)論。

1.3.4 判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2009年版乳腺癌HER2檢測(cè)指南判定。強(qiáng)陽(yáng)性染色（+++）：染色深，且染色細(xì)胞比例超過50%者；陽(yáng)性染色（++）：染色強(qiáng)度中等，且染色細(xì)胞比例25%～50%者；弱陽(yáng)性染色（+）：染色較淺，且染色細(xì)胞比例10%～25%者；陰性染色（-）：定位處沒有染色，或者染色細(xì)胞比例＜10%者。

1.4 臨床資料分類 乳腺癌病患分類分級(jí)采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC和美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)AJCC制定的TNM分期第6版方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 RCL表達(dá)為胞漿染色，鏡下呈均勻一致細(xì)顆粒狀，偶見胞膜胞核染色，呈灶性或多點(diǎn)散在分布。RCL在內(nèi)對(duì)照中多為弱表達(dá)（+）或不表達(dá)（-），乳腺癌組織內(nèi)表現(xiàn)為強(qiáng)表達(dá)（++～+++），見圖1。總體強(qiáng)表達(dá)率為85%（51/60），其在癌組織與內(nèi)對(duì)照中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，見表1）。

TAOK1表達(dá)為胞漿著色，鏡下呈均勻一致的棕黃色細(xì)顆粒狀，偶見胞膜線性著色。TAOK1在內(nèi)對(duì)照中多不表達(dá)（-），乳腺癌組織內(nèi)表達(dá)強(qiáng)弱不等（+～+++），見圖1?？傮w表達(dá)率為90%（54/60），其在癌組織與內(nèi)對(duì)照中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，見表1）。

14-3-3 zeta表達(dá)為胞漿著色，鏡下呈均勻一致的棕黃色細(xì)顆粒狀。TAOK1在內(nèi)對(duì)照中多不表達(dá)（-），乳腺癌組織內(nèi)表達(dá)強(qiáng)弱不等（+～+++），見圖1。總體表達(dá)率為80%（48/60），其在癌組織與內(nèi)對(duì)照中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，見表1）。

ZNF706表達(dá)為胞核著色為主，偶見胞漿染色，染色中等到弱。ZNF706在內(nèi)對(duì)照中多不表達(dá)（-），乳腺癌組織內(nèi)表達(dá)強(qiáng)弱不等（+～+++），見圖1?？傮w表達(dá)率為83%（50/60），其在癌組織與內(nèi)對(duì)照中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，見表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的表達(dá)情況（低倍鏡：×100，高倍鏡：×400）

表1 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的基因蛋白表達(dá)與乳腺癌及癌旁組織表達(dá)比較（n=60）

2.2 4個(gè)新靶基因的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性本研究進(jìn)一步對(duì)RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706在乳腺癌組織中的表達(dá)情況與患者臨床病理資料進(jìn)行歸類，通過對(duì)其表達(dá)情況與各臨床病理因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出：RCL的表達(dá)在不同腫瘤大?。≒=0.012）、病理分級(jí)（P=0.044）之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）；TAOK1、14-3-3 zeta的表達(dá)與年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）；ZNF706的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）有關(guān)（P＜0.05），與年齡、腫塊大小、病理分級(jí)無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.3 4個(gè)新靶基因的表達(dá)與乳腺癌分子分型標(biāo)志物的相關(guān)性 ER、PR、HER2、Ki67是乳腺癌分子分型的重要依據(jù)，本研究對(duì)樣本標(biāo)志物的表達(dá)與本課題研究的新基因表達(dá)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：RCL的表達(dá)與Ki67高低[5]之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），Ki67≥14組中RCL表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性明顯增多；TAOK1的表達(dá)與ER、HER2表達(dá)之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031、P=0.04），ER（-）組中TAOK1表達(dá)升高，在HER2（+）中表達(dá)亦增多；14-3-3 zeta和ZNF706的表達(dá)分別與ER的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01、P=0.038），在ER（+）組中14-3-3 zeta和ZNF706均呈高表達(dá)。見表3。

表2 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

表3 RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706的表達(dá)與乳腺癌分子分型標(biāo)志物的關(guān)系

3 討論

隨著腫瘤分子標(biāo)志物研究的不斷深入，越來越多的標(biāo)志物被逐步發(fā)現(xiàn)，它們與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，其表達(dá)的改變?cè)趨f(xié)助診斷疾病、指導(dǎo)臨床治療方面有著重要價(jià)值。近年來，除對(duì)乳腺癌進(jìn)行傳統(tǒng)的組織學(xué)分類以外，根據(jù)分子標(biāo)志物表達(dá)的不同，還可以將其分為4個(gè)分子亞型：luminal A型、luminal B型、HER2型、基底樣/三陰性乳腺癌[6]。臨床上雖然對(duì)已分型的各個(gè)亞型制定了有針對(duì)性的治療方案，然而，乳腺癌癌基因的研究仍不夠透徹，導(dǎo)致亞型分類不完善，同亞型的患者預(yù)后和對(duì)藥物的敏感性依然存在差異，這大大阻礙了乳腺癌個(gè)性化治療的開展[7]。因此，探尋乳腺癌中新的分子標(biāo)志物，更加科學(xué)地實(shí)施個(gè)性化診療顯得意義重大。

目前，在乳腺癌中已發(fā)現(xiàn)多種成熟的分子標(biāo)志物，包括HER2、ER、PR、Ki67等。其中HER2被認(rèn)為是乳腺癌細(xì)胞增殖的驅(qū)動(dòng)基因，其高表達(dá)往往提示不良預(yù)后。研究表明，在乳腺癌中HER2和ETV1可以協(xié)同上調(diào)RCL的表達(dá)[8]；同時(shí)RCL是C-MYC反應(yīng)基因，其反應(yīng)產(chǎn)物參與嘌呤或嘧啶補(bǔ)救合成、糖酵解和血管形成，因此與乳腺癌的進(jìn)展高度相關(guān)[9]。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，RCL表達(dá)在7個(gè)不同類型的腫瘤（淋巴瘤、結(jié)腸癌、腦腫瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、白血?。┲斜磉_(dá)上調(diào)，也同樣表明RCL廣泛參與腫瘤形成。本研究顯示RCL在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)，且高表達(dá)組中腫瘤大小、病理分級(jí)、Ki67明顯增大，提示RCL在乳腺癌分化、增殖進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。RCL的強(qiáng)表達(dá)提示乳腺癌分化低、惡性程度高，預(yù)后較差，其與腫瘤的轉(zhuǎn)移并無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果基本一致。然而在本研究中未發(fā)現(xiàn)RCL與HER2基因之間存在聯(lián)系，這可能是由于RCL的強(qiáng)表達(dá)是由ETV1和HER2共同控制上調(diào)所引起的，具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

有絲分裂元激活蛋白激酶（metogen-activated protein kinases，MAPK）通路是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的又一重要信號(hào)通路。MAPK可經(jīng)Ras通路磷酸化激活，提高乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。TAOK1處于p38MAPK上游，其可通過磷酸化MKK3進(jìn)一步激活p38MAPK，調(diào)節(jié)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、抑制凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TAOK1在乳腺癌組織中高表達(dá)，暗示其與乳腺癌之間存在聯(lián)系。然而TAOK1與患者臨床病理因素之間并無相關(guān)性，可能是由于本研究中樣本量較少，或是TAOK1信號(hào)調(diào)控并不占據(jù)主要地位[11]。

14-3-3 zeta蛋白是細(xì)胞調(diào)控的又一重要信號(hào)分子，作用包括：抑制整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程，造成G1/S、G2/M阻滯；作用于多種細(xì)胞因子受體，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄的調(diào)控；通過對(duì)MAPK、Bcl-2和凋亡相關(guān)激酶調(diào)控參與細(xì)胞凋亡過程[12]。有研究表明，14-3-3 zeta在多種癌癥中高表達(dá)，若敲除人肺腺癌A549細(xì)胞的14-3-3 zeta基因，可以恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)失巢凋亡的敏感性，控制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，說明14-3-3 zeta高表達(dá)可以通過抑制凋亡來促進(jìn)癌癥進(jìn)展。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 zeta在乳腺癌中高表達(dá)與內(nèi)分泌治療的耐藥相關(guān)，14-3-3 zeta高表達(dá)的患者在進(jìn)行內(nèi)分泌治療后耐藥率顯著高于低表達(dá)組[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，14-3-3 zeta在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)，然而統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其與臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)，推測(cè)其與腫瘤分化、進(jìn)展無直接聯(lián)系，不能提示預(yù)后。14-3-3 zeta在ER（+）組中表達(dá)顯著高于ER（-）組，提示14-3-3 zeta在乳腺癌中的上調(diào)可能受到激素影響，進(jìn)一步分析14-3-3 zeta（+）和ER（+）的患者內(nèi)分泌治療的預(yù)后可能會(huì)得到其與內(nèi)分泌治療抵抗的相關(guān)性結(jié)論，這將成為本課題組后續(xù)研究的一個(gè)方向。

ZNF706是一種結(jié)構(gòu)蛋白，屬于鋅指蛋白家族中的成員，它與表觀遺傳以及核信號(hào)轉(zhuǎn)錄相關(guān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于ZNF706的研究均較少，其具體功能未知。近期基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ZNF706在胃癌和肝癌中的基因拷貝數(shù)和表達(dá)上調(diào)，這些結(jié)果提示ZNF706與癌癥相關(guān)[14-15]。本課題對(duì)ZNF706在乳腺癌中的臨床病理意義進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)ZNF706在內(nèi)對(duì)照中表達(dá)少，而在乳腺癌組織中廣泛表達(dá)，且統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、ER（+）有關(guān)，提示ZNF706與乳腺癌轉(zhuǎn)移存在一定聯(lián)系，可能成為新的乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新指標(biāo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于乳腺癌組織中RCL、TAOK1、14-3-3 zeta、ZNF706蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了初步研究，這4種蛋白表達(dá)與乳腺癌密切相關(guān)，其中RCL、ZNF706分別與腫瘤大小、病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)，對(duì)于乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有一定的臨床意義。未來希望能深入論證這4種蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，為乳腺癌的預(yù)后評(píng)估、治療的新方向提供理論依據(jù)。