夏立廣，李仲榮，劉森清，王永飚，朱利斌，趙一鳴

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

神經(jīng)遞質(zhì)是發(fā)生突觸聯(lián)系的中介，經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)目前已經(jīng)明確的膽堿類主要為乙酰膽堿（acetylcholine，Ach），單胺類包括腎上腺素、去甲腎上腺素（noradrenaline，NA）、多巴胺、5-羥色胺，氨基酸類包括谷氨酸、門冬氨酸、γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）、甘氨酸等，以及其他的神經(jīng)遞質(zhì)包括一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳、前列腺素、P物質(zhì)、組氨和神經(jīng)肽等。幾乎所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的遞質(zhì)均存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)中。本實(shí)驗(yàn)研究有代表性的Ach、NO、NA、GABA這4種遞質(zhì)在腸神經(jīng)干細(xì)胞和腦神經(jīng)干細(xì)胞間的差異，為今后如何獲得合適的、有功能的、能長(zhǎng)期使用的移植干細(xì)胞提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12、N2-supplement、B27-supplement、青霉素/鏈霉素、0.25%胰酶-EDTA為Gibco公司產(chǎn)品；bFGF、EGF、粗膠原酶、維甲酸、錐蟲(chóng)藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品；二巰基乙醇、HFN為Chemicon公司產(chǎn)品；兔抗GABA、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neurona nitric oxide synthase，nNOS）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransterase，ChAT）、多巴胺β羥化酶（dopamine β-hydroxylase，DβH）、兔IgG同型對(duì)照抗體為abcam公司產(chǎn)品；DyLight488熒光二抗為KPL公司產(chǎn)品；酶標(biāo)山羊抗兔二抗為PTG公司產(chǎn)品；固定通透試劑盒為BD公司產(chǎn)品；DAB顯示試劑盒為武漢博士德產(chǎn)品；低熔點(diǎn)瓊脂糖為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為孕20 d的SD大鼠（清潔級(jí)），由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 培養(yǎng)液及2種神經(jīng)干細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)及鑒定方法 從孕20 d的同一SD胚鼠中分別提取腸神經(jīng)干細(xì)胞和腦神經(jīng)干細(xì)胞，采用改良的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)傳代，取傳代培養(yǎng)6～10 d后得到的2種不同來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞球。參見(jiàn)文獻(xiàn)[1-2]。

1.3 神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)志物 Ach、NO、NA、GABA這4種遞質(zhì)相對(duì)應(yīng)的標(biāo)志物分別為ChAT、nNOS、DβH、GABA抗體。

1.4 瓊脂糖預(yù)包埋免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)選用的一抗分別為：1∶15 000抗GABA，1∶100抗nNOS，1∶1 000抗ChAT，1∶2 000抗DβH。將傳代培養(yǎng)得到2種不同來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞球進(jìn)行瓊脂糖預(yù)包埋，分別制成石蠟切片。常規(guī)處理經(jīng)GABA、nNOS、ChAT、DβH免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色后蘇木素復(fù)染。具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)選用的一抗分別為：1∶300抗GABA，1∶30抗nNOS，1∶100抗ChAT，1∶200抗DβH。分別設(shè)有同型對(duì)照組，流式細(xì)胞儀測(cè)定2種不同來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞GABA、nNOS、ChAT、DβH熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，每次每組測(cè)3管細(xì)胞，重復(fù)3次，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞合計(jì)率。具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖預(yù)包埋免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 分別設(shè)有空白對(duì)照組（見(jiàn)圖1）、GABA、nNOS、ChAT、DβH組（見(jiàn)圖2-5），其陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿為黃色。

保持顯微鏡下相同條件下，全部用手動(dòng)設(shè)置等條件下，拍攝400倍照片，每張切片隨機(jī)拍攝3個(gè)視野，重復(fù)3次，每組共9張，并使用IPP6.0軟件分析，把圖像中呈現(xiàn)黃色的區(qū)域作為AOI（area of interest）進(jìn)行分析。選擇測(cè)量參數(shù)為累積面積、平均光密度和累積光密度（integrated optical density，IOD）。2種不同神經(jīng)干細(xì)胞GABA、nNOS、ChAT、DβH組與相應(yīng)的空白對(duì)照組相比：腸神經(jīng)干細(xì)胞nNOS組、ChAT組累積面積、平均光密度和IOD與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦神經(jīng)干細(xì)胞nNOS組、ChAT組、DβH組累積面積、平均光密度和IOD與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 空白對(duì)照組神經(jīng)球瓊脂糖預(yù)包埋石蠟切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×400）

圖2 GABA組神經(jīng)球瓊脂糖預(yù)包埋石蠟切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×400）

圖3 nNOS組神經(jīng)球瓊脂糖預(yù)包埋石蠟切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×400）

圖4 ChAT組神經(jīng)球瓊脂糖預(yù)包埋石蠟切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×400）

圖5 DβH組神經(jīng)球瓊脂糖預(yù)包埋石蠟切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色（×400）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示：腸神經(jīng)干細(xì)胞GABA、nNOS、ChAT、DβH陽(yáng)性細(xì)胞合計(jì)率分別為1.59%、14.97%、5.43%、1.36%，其中nNOS、ChAT與相應(yīng)的同型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而腦神經(jīng)干細(xì)胞GABA、nNOS、ChAT、DβH陽(yáng)性細(xì)胞合計(jì)率分別為1.68%、6.14%、25.42%、9.30%，其中nNOS、ChAT、DβH與相應(yīng)的同型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

綜合上述結(jié)果提示，腸神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)遞質(zhì)為NO和Ach，且以NO為主；腦神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)遞質(zhì)為NO、Ach和NA，且以Ach為主。GABA在2種神經(jīng)干細(xì)胞中均無(wú)明顯表達(dá)；NA在腦神經(jīng)干細(xì)胞中有表達(dá)，而在腸神經(jīng)干細(xì)胞中不表達(dá)。

通過(guò)比較均表達(dá)NO和Ach的2種不同來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞nNOS組和ChAT組相關(guān)參數(shù)顯示，腸神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的NO總量以及每個(gè)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞的NO的含量均較腦神經(jīng)干細(xì)胞高；而腦神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的Ach總量較腸神經(jīng)干細(xì)胞高，但每個(gè)ChAT陽(yáng)性細(xì)胞的Ach含量卻是腸神經(jīng)干細(xì)胞高。

3 討論

神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)突觸聯(lián)系傳遞各種信息而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能的作用，幾乎所有的神經(jīng)遞質(zhì)均存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中。

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，發(fā)育腦及原代培養(yǎng)的腦細(xì)胞研究證明，在突觸形成之前GABA作用具有多樣性，但在神經(jīng)發(fā)育早期，GABA的確切作用仍不清楚。Pontes等[3]研究表明，GABA通過(guò)離子移變A受體和代謝性B受體，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行正性刺激。在消化系統(tǒng)中GABA除了作為神經(jīng)遞質(zhì)外，還是一種胃腸激素。Weigert等[4]研究證實(shí)GABA參與迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)的胃泌素和生長(zhǎng)抑素的釋放。在幽門結(jié)扎的大鼠中，GABA和巴氯芬通過(guò)增加胃黏液分泌，抑制胃蛋白酶分泌，降低胃黏膜細(xì)胞脫落，發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用[5]。有報(bào)道[6]稱GABA可通過(guò)GABA（B）受體的介導(dǎo)抑制腸段的收縮。我們的數(shù)據(jù)顯示GABA在腸神經(jīng)干細(xì)胞及腦神經(jīng)干細(xì)胞中均無(wú)明顯表達(dá)，考慮原因可能是我們所采用的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液不適合神經(jīng)干細(xì)胞的GABA能神經(jīng)元表達(dá)，GABA能神經(jīng)元是產(chǎn)生和釋放GABA的主要來(lái)源。有報(bào)道[7]稱Mash1與Hes1共表達(dá)時(shí)，能夠促進(jìn)GABA能神經(jīng)元形成，而骨形成蛋白-2[8]可促進(jìn)室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞向GABA能神經(jīng)元的分化，增加這些因素的表達(dá)及含量可能也有利于我們所培養(yǎng)的這2種神經(jīng)干細(xì)胞的GABA能神經(jīng)元表達(dá)。

表1 神經(jīng)干細(xì)胞4種神經(jīng)遞質(zhì)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 神經(jīng)干細(xì)胞4種神經(jīng)遞質(zhì)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）

與空白對(duì)照組相同指標(biāo)比：aP＜0.05

組別 累計(jì)面積 平均光密度 IOD腸神經(jīng)干細(xì)胞 腦神經(jīng)干細(xì)胞 腸神經(jīng)干細(xì)胞 腦神經(jīng)干細(xì)胞 腸神經(jīng)干細(xì)胞 腦神經(jīng)干細(xì)胞空白對(duì)照組 1 261±24 1 245±40 0.095±0.005 0.096±0.004 122±7 124±6 GABA組 1 299±43 1 260±58 0.096±0.003 0.100±0.007 127±6 128±10 nNOS組 34 641±1 195a 17 845±601a 0.185±0.004a 0.132±0.004a 5 954±195a 2 556±103a ChAT組 24 895±874a 64 921±2 912a 0.153±0.005a 0.139±0.004a 4 011±187a 11 718±485a DβH組 1291±65 43 788±1 517a 0.100±0.009 0.145±0.007a 129±14 7 208±419a

表2 神經(jīng)干細(xì)胞4種神經(jīng)遞質(zhì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。在正常腦組織內(nèi)，NO對(duì)于神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖具有負(fù)相的調(diào)節(jié)作用，但在腦損傷后，在不同的神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞中過(guò)剩的NO促進(jìn)了神經(jīng)發(fā)生[9]。薩喆燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NO促進(jìn)大鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞分化。有研究表明NO是一種受神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子影響的旁分泌信使，通過(guò)對(duì)新產(chǎn)生的神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)節(jié)來(lái)控制神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和分化[11]。也有研究表明NO的調(diào)節(jié)是雙向的，神經(jīng)干細(xì)胞nNOS表達(dá)既促進(jìn)其增殖也是其分化所必需的；而神經(jīng)元的nNOS表達(dá)抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖，阻礙其分化[12]。NO在消化道系統(tǒng)[13]中的作用不言而喻，腸神經(jīng)元直接控制腸壁肌肉活動(dòng)，它主要通過(guò)興奮性的膽堿能神經(jīng)和抑制性的氮能神經(jīng)發(fā)揮作用。NO可以松弛離體人類正常結(jié)腸及無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段巨結(jié)腸肌條，是正常結(jié)腸及無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥結(jié)腸松弛反應(yīng)的遞質(zhì)。氮能神經(jīng)元功能異?；蛉毕菔悄c神經(jīng)肌肉疾病的一個(gè)重要病因[14-16]，可導(dǎo)致先天性巨結(jié)腸、賁門失弛緩和幽門肥厚性狹窄等疾病。這些研究結(jié)果給由NO引起的臨床上一些神經(jīng)系統(tǒng)性疾病治療帶來(lái)可喜的理論前景。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NO在2種神經(jīng)干細(xì)胞中均有表達(dá)，但腸神經(jīng)干細(xì)胞NO的表達(dá)量及每個(gè)nNOS陽(yáng)性細(xì)胞NO的含量較腦神經(jīng)干細(xì)胞高，這提示在相同的條件下腸神經(jīng)干細(xì)胞可能比腦神經(jīng)干細(xì)胞更適合作為誘導(dǎo)氮能神經(jīng)元的種子細(xì)胞，治療上述疾病。

在大腦內(nèi)，末梢釋放Ach的膽堿能神經(jīng)元廣泛分布在腦干及前腦，主要參與機(jī)體心血管活動(dòng)、攝食、覺(jué)醒、感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)等的調(diào)節(jié)。Winkler等[17]將基因修飾的膽堿能細(xì)胞移植于大鼠基底神經(jīng)核后可以改善空間定向能力。另外，膽堿能細(xì)胞對(duì)記憶功能也有改善作用[18]。有研究表明Ach促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的增殖和分化，拮抗劑阿托品則阻斷這種增強(qiáng)作用，并抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化[19]。膽堿能神經(jīng)元是腸道種類最多的一種神經(jīng)元，包括感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、分泌及中間神經(jīng)元。Ach是腸道副交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)及盆神經(jīng)主要的神經(jīng)遞質(zhì)，膽堿能神經(jīng)元對(duì)腸道動(dòng)力主要起興奮的作用。本組數(shù)據(jù)顯示Ach在2種神經(jīng)干細(xì)胞中均有表達(dá)，腦神經(jīng)干細(xì)胞Ach的表達(dá)總量較腸神經(jīng)干細(xì)胞高，但每個(gè)ChAT陽(yáng)性細(xì)胞的含量卻比腸神經(jīng)干細(xì)胞低。這提示在相同的條件下腦神經(jīng)干細(xì)胞比腸神經(jīng)干細(xì)胞含有更多膽堿能神經(jīng)元，但兩者間不可以認(rèn)為只有量的不同。這可能與腸神經(jīng)干細(xì)胞含量較少，有較多其他組織細(xì)胞混雜有關(guān)，如果將腸神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步純化的話，膽堿能神經(jīng)元的含量可能會(huì)得到提高，也同樣適合作為誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元的種子細(xì)胞，治療相關(guān)的疾病。有報(bào)道[20]稱Lhx8高表達(dá)促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞往膽堿能神經(jīng)元分化，是否試用其他神經(jīng)干細(xì)胞有待進(jìn)一步研究。

中樞去甲腎上腺素能神經(jīng)元胞體在藍(lán)斑聚集，發(fā)出神經(jīng)纖維投射到腦的各個(gè)部位，在腦內(nèi)形成了彌散連接，構(gòu)成了中樞NA發(fā)揮作用的神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)，參與心血管活動(dòng)、體溫、情緒活動(dòng)的調(diào)節(jié)，也與維持大腦皮質(zhì)的覺(jué)醒狀態(tài)有關(guān)。有研究[21]報(bào)道基因敲除小鼠絕大部分難以存活，其主要原因是藍(lán)斑不能合成NA來(lái)完成機(jī)體多種功能的調(diào)節(jié)。在消化系統(tǒng)，交感神經(jīng)末梢釋放NA，通過(guò)其受體Naα對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)起抑制作用。有學(xué)者認(rèn)為，功能性胃排空障礙是胃腸交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，胃壁釋放NA或其他抑制性物質(zhì)直接與胃腸平滑肌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，阻止胃腸平滑肌中的副交感神經(jīng)釋放Ach，從而抑制胃的肌電活動(dòng)，延緩胃的排空，這是目前被認(rèn)為產(chǎn)生這種疾病的主要發(fā)病機(jī)制[22]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示NA只在腦神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)，在腸神經(jīng)干細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果及流式數(shù)據(jù)顯示兩者在NA方面差異較大。這可能與這2種神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源本身屬性有關(guān)，腦神經(jīng)干細(xì)胞可能更適合作為誘導(dǎo)去甲腎上腺素能神經(jīng)元的種子細(xì)胞，治療相關(guān)的疾病。此外，Mong等[23]報(bào)道通過(guò)對(duì)胚胎干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)男盘?hào)條件下導(dǎo)入Phox2b，去甲腎上腺素能神經(jīng)元可以高效率誘導(dǎo)，為獲得更多特定的去甲腎上腺素能神經(jīng)元種子細(xì)胞提供可能。