魏小潔，郭曲練，張艷峰

Atosiban及納洛酮對縮宮素鎮(zhèn)痛作用的影響

魏小潔1，郭曲練2，張艷峰2

目的觀察atosiban和納洛酮對縮宮素(oxytocin,OT)中樞痛覺調(diào)制作用的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為鞘內(nèi)注射組和側(cè)腦室注射組2個大組。每個大組又分為7個劑量組：生理鹽水+OT組(C組)；atosiban+OT高、中、低劑量組；納洛酮+ OT高、中、低劑量組。各組大鼠在切割給藥后的10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h進行機械性痛閾測定，檢測其變化情況。結(jié)果鞘內(nèi)和側(cè)腦室內(nèi)預(yù)注射atosiban大鼠在注射OT后各時間點痛閾均低于C組(P<0.05)；預(yù)注射納洛酮大鼠注射中、低劑量OT后痛閾較C組大鼠降低(P<0.05)；預(yù)注射納洛酮大鼠注射0.25 nmol OT后其痛閾與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論鞘內(nèi)和側(cè)腦室內(nèi)預(yù)注射atosiban可以阻斷OT的鎮(zhèn)痛作用，納洛酮部分阻斷OT鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

縮宮素;催產(chǎn)素受體;切割痛;阿片受體;atosiban;納洛酮

縮宮素(oxytocin，OT)參與脊髓和脊髓上中樞的痛覺調(diào)制，能緩解多種類型的疼痛[1]。OT在外周和中樞的多種生物學(xué)效應(yīng)主要是通過與OT受體(oxytocin receptor, OTR)結(jié)合而實現(xiàn)的。阿片類藥物是臨床使用最廣泛的鎮(zhèn)痛藥物[2,3]。目前，OTR在OT鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用及其與阿片類受體等其他受體途徑的關(guān)系尚不明確。本研究擬通過分別預(yù)先阻斷OTR和阿片受體，探討OT鎮(zhèn)痛作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及主要設(shè)備 OT(美國Sigma公司生產(chǎn))，Atosiban(深圳翰宇生物科技有限公司)，納洛酮注射液(2 ml：0.4 mg，湖南康哲制藥有限公司)，Von-Frey 纖維絲(美國Stolting公司)，PE-0503導(dǎo)管(O.D 0.5 mm，寧波安來軟件科技有限公司)，江灣大鼠腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實驗動物及分組 雄性清潔級SD大鼠112只，體重220～250 g，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物證書號X2003115968。大鼠隨機分為鞘內(nèi)注射和側(cè)腦室注射兩大組，每組56只，每個大組分7個劑量組，每組8只。劑量分組如下：(1)生理鹽水+OT 0.05 nmol組(對照組，C組)；(2)atosiban l.0 nmol+OT 0.05 nmol組；(3)atosiban l.0 nmol+OT 0.1 nmol組；(4) atosiban l.0 nmol+OT 0.25 nmol組；(5) 納洛酮0.5 μg +OT 0.05 nmol組；(6)納洛酮0.5 μg +OT 0.1 nmol組；(7)納洛酮0.5 μg +OT 0.25 nmol組。其中鞘內(nèi)注射組總?cè)萘繛?0 μl，側(cè)腦室注射總?cè)萘繛? μl，所有容積的稀釋均用生理鹽水。兩大組大鼠均在切割痛模型制作前5 min注射藥物，模型制作后即刻注射OT。

1.3 方法

1.3.1 大鼠腰段鞘內(nèi)置管模型的建立 大鼠以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，取L5～6間隙切開皮膚約1 cm，鈍性分離皮下組織，在L5棘突下部剪斷部分棘突，沿椎間隙緩慢置入PE 0503導(dǎo)管(預(yù)先在導(dǎo)管前端2～3 cm處以3-0慕斯線輕扎兩圈以便置管后的固定，以不阻塞管腔為宜)，向頭端送入2 cm，至脊髓腰膨大段。將導(dǎo)管與豎脊肌和皮下筋膜縫扎固定，經(jīng)皮下隧道將導(dǎo)管固定于頸部。單籠飼養(yǎng)3 d后經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管注射2%利多卡因20 μl來判斷導(dǎo)管的位置，如注射后30 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹，并在3 min內(nèi)恢復(fù)，說明置管成功。

1.3.2 大鼠側(cè)腦室置管模型的建立 大鼠麻醉后取俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，在頭部做一個1.5 cm的縱切口，鈍性分離皮下組織，用無菌棉球蘸3%過氧化氫輕輕擦拭大鼠顱骨表面，清晰顯露前囟，參考大鼠腦立體定位圖譜，選取側(cè)腦室最為明顯和寬大，且繞開運動皮質(zhì)等重要結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)點進行定位穿刺，本實驗選的坐標(biāo)點(以前囟為原點)為AP:0.92 mm，LR:1.2 mm，H :4.0 mm，用牙科鉆在定位點處鉆開顱骨，用22 G穿刺針做成的導(dǎo)管垂直刺入距顱骨表面4.0 mm的腦組織內(nèi)，明膠海綿止血后用牙科水泥將導(dǎo)管固定在顱骨上，導(dǎo)管露出顱骨表面0.5 cm，將導(dǎo)管尖端燒閉。大鼠側(cè)腦室置管3 d后可以進行下一步實驗。

1.3.3 大鼠切割痛模型的建立 分別取側(cè)腦室置管及鞘內(nèi)置管成功大鼠，依照Brennan 1996年介紹的方法，建立大鼠后足切割痛模型，即大鼠以2%異氟烷吸入麻醉后，俯臥位暴露右側(cè)足底掌面，消毒后在距離足跟部0.5 cm處用10號刀片沿足跟至足趾方向縱行切開1 cm的皮膚和筋膜，切口在掌面正中，挑起跖肌并將跖肌從中間縱行分離，保持跖肌兩端完整，無菌棉球輕壓止血后用4-0絲線縫合切口。

1.3.4 一般行為學(xué)觀察 鞘內(nèi)置管和側(cè)腦室置管術(shù)后每天觀察大鼠活動度、攝食飲水情況、步態(tài)、切口處皮膚以及肌張力、運動能力，有否異常行為情況等。

1.3.5 機械性觸誘發(fā)痛行為學(xué)的測定 用不同強度的Von Frey filaments纖毛，以從下到上、從小到大的順序依次垂直刺激大鼠損傷足爪的預(yù)測定部位，使其纖毛輕度彎曲成S形，并保持5 s左右，觀察其損傷側(cè)后肢縮腿反射，大鼠在刺激時間內(nèi)或在移開Von Frey filaments時立即出現(xiàn)快速的縮足反射，記為陽性反應(yīng)。若大鼠沒有出現(xiàn)此陽性反應(yīng)，則選擇其上一級的一個較大刻度的纖毛刺激足底部。依上述方法判斷若出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則繼續(xù)選擇其下的一個較小刻度的纖毛刺激，依此類推。每個號碼的纖毛刺激5次，每次間隔5 s，不同號碼間隔10 s，直至找到引起大鼠5次刺激，至少有連續(xù)3次引起大鼠明顯的縮腿反射但不是跳躍性的反射，則該纖維絲探針的壓力值為大鼠損傷側(cè)后肢機械刺激縮足閾值(paw withdrawal threshold，PWT)。同時可找到誘發(fā)縮腿反射或無縮腿反應(yīng)相鄰的兩個刺激強度后，繼續(xù)依序刺激4次，包括前面的2次，共6次刺激。利用中位法算出50%機械刺激縮足閾值。

2 結(jié) 果

納入實驗組大鼠在鞘內(nèi)置管、側(cè)腦室置管后均未出現(xiàn)明顯的運動及感覺功能受損表現(xiàn)，給藥后未出現(xiàn)不良反應(yīng)。各組大鼠在切割痛模型制作前5 min鞘內(nèi)預(yù)注射總?cè)萘烤鶠? μl的生理鹽水或atosiban 1 nmol，切割痛模型制作后即刻鞘內(nèi)給予0.05 nmol、0.1 nmol或0.25 nmol的OT，然后在各時間點測量機械性痛閾。痛閾測定結(jié)果表明，給予atosiban的大鼠在鞘內(nèi)注射OT后各時間點痛閾均明顯低于生理鹽水對照組(P<0.05)。側(cè)腦室內(nèi)預(yù)注射atosiban組大鼠痛閾變化結(jié)果與鞘內(nèi)注射組大鼠相似，給予atosiban的大鼠在鞘內(nèi)注射OT后各時間點痛閾均低于生理鹽水對照組(P<0.05)。各組大鼠在切割痛模型制作前5 min鞘內(nèi)預(yù)注射總?cè)萘烤鶠? μl的生理鹽水或0.5μg納洛酮，切割痛模型制作后即刻鞘內(nèi)給予0.05 nmol、0.1 nmol或0.25 nmol的OT，然后在各時間點測量機械性痛閾。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)注射納洛酮大鼠注射中、低劑量OT后痛閾較C組大鼠降低(P<0.05)；預(yù)注射納洛酮大鼠注射0.25 nmolOT后其痛閾與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。側(cè)腦室內(nèi)納洛酮預(yù)注射結(jié)果與鞘內(nèi)注射結(jié)果相符。見表1。

表1 大鼠鞘內(nèi)和側(cè)腦室置管后不同時間點對縮宮素鎮(zhèn)痛作用的影響 (n=8；±s )

注：對照組為生理鹽水組，A1、A2 、A3 表示1.0 nmol Atosiban分別對0.05、0.10、0.25 nmol縮宮素，N1、N2、N3表示0.5 μg納絡(luò)酮對0.05、0.10、0.25 nmol縮宮素；與對照組比較，①P<0.05

3 討 論

OT在外周和中樞的多種生物學(xué)效應(yīng)均是通過 OTR結(jié)合而實現(xiàn)的。OTR與精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)受體在結(jié)構(gòu)上高度同源，二者的作用部位也互有重疊[4]。因此，開發(fā)高度特異性的OTR激動藥和拮抗藥具有重要的意義。目前，應(yīng)用比較普遍的OTR拮抗藥是atosiban和OVTA，這兩種物質(zhì)均是小分子肽類。atosiban在臨床上主要用于早產(chǎn)的治療。同時，因其對OT的拮抗效果確切， atosiban在科研中應(yīng)用較多。因此，本研究選用atosiban觀察OT在中樞的痛覺調(diào)制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)或腦室內(nèi)注射atosiban均可以拮抗OT的鎮(zhèn)痛作用。Han等[5]證實，在杏仁中央核局部注射OT可以使大鼠對機械傷害性刺激和熱傷害性刺激的縮足潛伏期延長，而事先在該部位注射其受體阻斷藥atosiban可以消除這一作用。這說明OT在杏仁中央核的鎮(zhèn)痛作用是通過與OTR作用發(fā)揮的。在炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射atosiban同樣可以抵消OT對炎性痛的鎮(zhèn)痛作用，單獨鞘內(nèi)注射atosiban可以使炎性痛大鼠痛敏增加[6]。但切割痛的疼痛發(fā)生和維持機制與炎性痛和生理性抗傷害反應(yīng)均不同，在切割痛中OTR是否發(fā)揮了重要作用還不清楚。OT 的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能是OT與OTR作用后直接或間接使得膜電位的變化減小，阻斷了NMDA受體的激活。Breton等[7]的研究顯示，下丘腦視旁核釋放的OT能夠激活板層Ⅱ內(nèi)的谷氨酸能神經(jīng)元，激活的谷氨酸能神經(jīng)元會進一步活化脊髓Ⅰ、Ⅱ板層內(nèi)的GABA能神經(jīng)元，進而起到廣泛的抑制作用。

本實驗結(jié)果表明，鞘內(nèi)和側(cè)腦室內(nèi)注射atosiban均可以阻斷OT對切割痛的鎮(zhèn)痛作用，使注射OT后的痛閾明顯低于生理鹽水對照組，且在一定范圍內(nèi)加大OT的劑量并不能消除atosiban的阻斷作用，這可能是由于atosiban與OT起到的是非競爭性拮抗作用，或者atosiban與OTR的結(jié)合能力遠遠大于OT，使得OT很難競爭性從OTR上置換下atosiban，這顯示了atosiban的強大效能。

阿片類藥物是目前臨床應(yīng)用最廣泛的鎮(zhèn)痛藥物，但其可能導(dǎo)致便秘、呼吸抑制及成癮等諸多并發(fā)癥。因此，尋找理想的鎮(zhèn)痛藥物仍然是研究的熱點[8]。OTR是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，在與OT結(jié)合之后其構(gòu)象發(fā)生改變，將信號傳入胞內(nèi)第二信使，一方面可以使神經(jīng)元的興奮性改變從而產(chǎn)生即時反應(yīng)，另一方面也可以通過改變細胞內(nèi)基因表達而產(chǎn)生長時程反應(yīng)。阿片受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，免疫組化和原位雜交證實其分布與OTR分布有很多相同，且二者均為G蛋白偶聯(lián)受體，配體均參與多種形式的痛覺調(diào)制，這些都強烈提示OT作用部位可能與阿片受體有關(guān)[9]。而阿片受體是否參與OT相關(guān)的切割痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)尚無研究。納洛酮能競爭性的拮抗阿片類受體，能逆轉(zhuǎn)阿片受體激動劑的效應(yīng)[10]。本實驗結(jié)果顯示，在側(cè)腦室和鞘內(nèi)注射納洛酮能夠一定程度地降低OT的鎮(zhèn)痛作用，而隨著OT劑量的加大，納洛酮的阻斷作用相對減輕，這說明OT的鎮(zhèn)痛作用與阿片系統(tǒng)有關(guān)但又不完全依賴于阿片系統(tǒng)，而主要是通過OTR起到的。OT作用的這一特點為臨床在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中勾畫出一個相對獨立的切割痛痛覺調(diào)制網(wǎng)絡(luò)，這個網(wǎng)絡(luò)的上游或者下游通路可能對中樞感知痛覺起到重要作用，而這有待進一步的研究。

[1] Juif P E, Poisbeau P. Neurohormonal effects of oxytocin and vasopressin receptor agonists on spinal pain processing in male rats[J].Pain, 2013, 154(8): 1449-1456.

[2] 柳培雨, 田 毅, 王繼琛,等.布托啡諾對大鼠脊髓阿片受體表達的影響[J].武警醫(yī)學(xué), 2009, 20(11): 1013-1015.

[3] 楊 宇,楊 光,曾憲陽.梔子苷鎮(zhèn)痛作用及其機制初步研究[J].武警醫(yī)學(xué), 2013,24(3): 218-220.

[4] Yang J, Liang J Y, Zhang X Y,etal. Oxytocin, but not arginine vasopressin is involving in the antinociceptive role of hypothalamic supraoptic nucleus[J].Peptides, 2011, 32(5): 1042.

[5] Han Y, Yu L C. Involvement of oxytocin and its receptor in nociceptive modulation in the central nucleus of amygdala of rats[J].Neurosci Lett,2009,454(1):101.

[6] Gutierrez S, Liu B, Hayashida K,etal. Reversal of peripheral nerve injury-induced hypersensitivity in the postpartum period: role of spinal oxytocin[J].Anesthesiology, 2013, 118(1): 152.

[7] Breton J D, Poisbeau P, Darbon P. Antinociceptive action of oxytocin involves inhibition of potassium channel currents in lamina II neurons of the rat spinal cord[J].Mol Pain, 2009, 5: 63.

[8] 要小梅.氟比洛芬酯超前鎮(zhèn)痛對腹腔鏡膽囊切除術(shù)后疼痛的影響[J].武警醫(yī)學(xué), 2009, 20(7): 654-655.

[9] Gu X L, Yu L C. Involvement of opioid receptors in oxytocin-induced antinociception in the nucleus accumbens of rats[J].J Pain, 2007, 8(1): 85.

[10] 王 瑞,王 姝,睢大筼.納洛酮心血管保護作用研究進展[J].武警醫(yī)學(xué), 2011, 22(10): 907-909.

(2013-12-25收稿 2014-02-21修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Roleofatosibanandnaloxoneinanalgesiceffectsofoxytocin

WEI Xiaojie1, GUO Qulian2,and ZHANG Yanfeng2.1.Department of Anesthesiology, Hunan Provincial Corps Hospital,Chinese People’s Armed Police Forces, Changsha 410006,China;2.Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008，China

ObjectiveTo study the role of atosiban and naloxone in the analgesic effects of oxytocin (OT).MethodsMale SD rats were divided randomly into 2 groups, i.th group and i.c.v group. And both groups subdivided as below: N.S+OT (control group, C)；atosiban + OT low, medium and high dose groups；naloxone + OT low, medium and high dose groups. And the mechanical pain threshold was tested 10 min，30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h after incision in all of the rats.ResultsI.th and i.c.v administration of atosiban could thoroughly inhibit the analgesia effect of OT(P<0.05); compared with control group, the pain threshold of rats with naloxone only decreased after low and medium doses of OT(P<0.05); the pain threshold had no significant differences between the high dose OT treated rats and the control group(P>0.05).ConclusionsThe analgesic effect of OT can be totally inhibited by i.t.h or i.c.v atosiban, but partly depressed by naloxone.

oxytocin; oxytocin receptor; incisional pain; opioid receptor; atosiban; naloxone

魏小潔，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：weixiaojie5@126.com

1.410006長沙，武警湖南總隊醫(yī)院麻醉科；2.410008長沙，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院麻醉科

R441.1