胡海濤　邱霞　熊冰

[摘 要] 目的 探討蛋白酶激活受體_1（PAR_1）在高壓氧預(yù)處理（HBOP）誘導(dǎo)的大鼠腦出血后神經(jīng)保護(hù)中的作用。方法 （1）SD大鼠接受連續(xù)5次HBOP或假預(yù)處理（SP），預(yù)處理結(jié)束24h后，建立基底節(jié)區(qū)腦出血模型，72h后處死，觀察腦水含量，神經(jīng)功能評分，TUNEL法檢測血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡，免疫組化方法檢測血腫周圍組織PAR_1的表達(dá)。（2）SD大鼠HBOP預(yù)處理前基底節(jié)區(qū)給予PAR_1激動劑（PAR_AP）或生理鹽水，接受連續(xù)5次HBOP，預(yù)處理結(jié)束24h后，建立基底節(jié)區(qū)腦出血模型，72h后處死，觀察腦水含量、神經(jīng)功能評分，血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡和PAR_1的表達(dá)。結(jié)果 高壓氧預(yù)處理減輕大鼠腦出血后72h血腫周圍腦組織水腫[（814±08）% vs （802±06）%，P<001]，改善神經(jīng)功能評分，減少血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡，HBOP降低了血腫周圍組織PAR_1的表達(dá)（P<005）。HBOP前給予PAR_AP激活PAR_1受體，消除了HBOP誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)論 高壓氧預(yù)處理通過減輕腦組織水腫，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)作用，下調(diào)PAR_1的表達(dá)是可能的作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 高壓氧；預(yù)處理；腦出血；腦水腫；蛋白酶激活受體

中圖分類號：R7433 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009_816X（2014）02_0098_04

doi：103969/jissn1009_816x20140204Effects of Protease_activated Receptor_1（PAR_1） on Brain Tolerance after Experimental Intracerebral Hemorrhage Induced by Hyperbaric Oxygen Preconditioning HU Hai_tao， QIU Xia， XIONG Bing Department of Neurology， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Medical College， Zhejiang 310009， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of protease_activated receptor_1（PAR_1） on brain tolerance after experimental intracerebral hemorrhage induced by hyperbaric oxygen preconditioning Methods This study had two experimental groups Group 1， Sprague_Dawley rats received five consecutive sessions of hyperbaric oxygen preconditioning （HBOP） or sham preconditioning （SP） Twenty_four hours after preconditioning， rats received an infusion of autologous blood into the caudate They were killed 72 hours later ，and brain water content， neurological function， neuronal cell apoptosis and PAR_1 expression were measured Group 2， rats received an intracaudate injection of PAR_1 agonist peptide （PAR_AP） or normal saline before HBOP， then they received five consecutive sessions of HOBP Twenty_four hours after HOBP， rats received an intracaudate blood infusion Brain water content， neurological function， neuronal cell apoptosis and PAR_1 expression were measured 72 hours after the rats were killed Results HOBP reduced perihematomal edema 72 hours after ICH （（814±08）% vs （802±06）%，P<001）， reduced neurological deficits and decreased perihematoma neuronal cell apoptosis and improved PAR_1 expression（P<005） Intracaudate infusion of PAR_AP activated PAR_1 expression and abolished HBOP induced neuro_protection Conclusions HOBP attenuates brain edema formation， neuronal cell apoptosis and neurological deficits after ICH Inhibition of PAR_1 contributes to that effects

[Key words] Hyperbaric oxygen； Preconditioning； Intracerebral hemorrhage； Brain edema； Protease_activated protein_1

高壓氧預(yù)處理（HBOP）誘導(dǎo)的“腦缺血耐受”現(xiàn)象在很多動物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)[1，2]。Qin[3]等研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)5天HBOP能顯著減輕SD大鼠腦出血24h后腦水腫，誘導(dǎo)腦出血后“腦損傷耐受”，但作用機(jī)制尚不明確。腦出血后血腫釋放的凝血酶是誘導(dǎo)腦組織損傷過程的關(guān)鍵因子之一，與神經(jīng)細(xì)胞凋亡、腦組織水腫密切相關(guān)。高濃度的凝血酶主要通過結(jié)合蛋白酶激活受體_1（PAR_1），激活RhoA、蛋白激酶C（PKC）和絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）等通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[4]，凝血酶抑制劑能降低其毒性作用。以往的體外研究也發(fā)現(xiàn)，凝血酶預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)元保護(hù)作用是通過PAR_1介導(dǎo)的，PAR_1激動劑可以模擬凝血酶預(yù)處理的作用[5]。本文通過觀察HBOP以及PAR_1激動劑（PAR_AP）對實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血后腦水腫，神經(jīng)功能評分以及血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討PAR_1在HBOP誘導(dǎo)腦出血后腦保護(hù)中的作用。

1 資料與方法

11 動物及分組：選用雄性Spradgue_Dawley大鼠48只，體重300～350g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)分為2個部分：（1）將大鼠隨機(jī)分為高壓氧預(yù)處理（HBOP）組（n=12）和假預(yù)處理（SP）組（n=12）。最后一次預(yù)處理結(jié)束24h后，立體定向基底節(jié)內(nèi)注射大鼠自體股動脈血100μL建立基底節(jié)腦出血模型。模型建立72h后，進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分，將其中12只大鼠（HBOP組和SP組各6只）斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量；另外12只大鼠（HBOP組和SP組各6只）處死，取腦組織切片；（2）將24只大鼠分為PAR_1激動劑（PAR_AP）組（n=12）和溶劑對照（Vehicle）組（n=12），其中PAR_AP組在預(yù)處理前1h，右側(cè)尾狀核內(nèi)給予PAR_AP（5μl，10nmol，美國Anaspec公司），溶劑對照組給予生理鹽水5μl。預(yù)處理結(jié)束后24h，制備大鼠腦出血模型，模型建立72h后，評價大鼠神經(jīng)功能，測定腦組織水含量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和PAR_1的表達(dá)。

12 方法：

121 高壓氧預(yù)處理：HBOP組大鼠置入動物實(shí)驗(yàn)用高壓氧艙內(nèi)，以醫(yī)用純氧作氣源，15min內(nèi)勻速加壓至3個絕對大氣壓（1個絕對大氣壓≈100kPa）。通過調(diào)整進(jìn)出口氣流量維持氧艙內(nèi)壓力平穩(wěn)，并維持艙內(nèi)氧濃度99%以上，持續(xù)1小時后于30分內(nèi)均勻降壓至1個絕對大氣壓，1次/天，連續(xù)5天。SP組大鼠也置入高壓氧艙內(nèi)，只暴露于1個絕對大氣壓的空氣中，1次/天，連續(xù)5天。

122 大鼠基底節(jié)腦出血模型的建立：大鼠最后一次預(yù)處理結(jié)束24h后，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥麻醉（40mg/kg），右側(cè)股動脈插管，取血約03ml，立體定位儀（Kopf Instruments，Tujunga，CA）下右側(cè)尾狀核注射非肝素化自體血100μl（坐標(biāo)：囟門前02mm，向右40mm，腹側(cè)進(jìn)針55mm），微泵以1μl/min的速度注入，注畢停留2min后緩慢退針。術(shù)中無菌操作，保持體溫在375℃，并監(jiān)測平均動脈壓、血?dú)夥治觥⒓t細(xì)胞壓積和血糖等，術(shù)后自由進(jìn)食、進(jìn)水。

123 神經(jīng)功能評分：在大鼠術(shù)前和術(shù)后72h，采用Hua[6]等的大鼠轉(zhuǎn)角試驗(yàn)和前肢放置試驗(yàn)來判斷神經(jīng)功能缺損的程度。轉(zhuǎn)角試驗(yàn)：將大鼠放在角度為30°的夾角內(nèi)，觀察其轉(zhuǎn)身出角的轉(zhuǎn)向，向左或向右，連續(xù)10次，每次間隔時間不小于15秒，神經(jīng)功能得分=（右轉(zhuǎn)次數(shù)/總次數(shù)）×100%。大鼠前肢放置試驗(yàn)：大鼠前爪懸空，每次試驗(yàn)用一側(cè)胡須輕觸桌面，正常反應(yīng)為大鼠前肢即刻抓向桌面，記1分，共10次，記錄前肢正確放置次數(shù)的百分比。

124 腦組織水含量：大鼠腦出血模型制作72h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉深麻醉（60mg/kg），快速斷頭完整取出腦組織，以皮層穿刺點(diǎn)為中心作一冠狀位斷層（層厚約3mm），該斷層腦組織再沿中線分離為右側(cè)皮層、右側(cè)基底節(jié)、左側(cè)皮層、左側(cè)基底節(jié)，另取小腦作為參照。然后將標(biāo)本在100℃下烘干24h再進(jìn)行稱量干質(zhì)量。腦組織水含量（%）=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

125 TUNEL染色和免疫組化染色：大鼠在相應(yīng)時間點(diǎn)予戊巴比妥過量麻醉（60mg/kg），含4%多聚甲醛的01mol/L PBS液（pH 74）心內(nèi)灌注，至大鼠四肢變硬、發(fā)白，斷頭完整取出腦組織，4℃下在上述固定液中繼續(xù)固定4～6h后，轉(zhuǎn)移至30%蔗糖中脫水3～4d，待腦組織沉到底部，用OCT包埋劑包埋后進(jìn)行冰凍切片，厚度為18μm。取切片行TUNEL法免疫組化染色，鏡下觀察血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（方法按TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒說明書進(jìn)行）。PAR_1的染色步驟：切片室溫干燥5min，放入03%Tritonl00的01mol/L PBS液浸泡15min，用10%的正常山羊血清孵育30min。加入兔抗鼠單克隆PAR_1（濃度1：500，Cell signaling公司），4℃過夜。添加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育90min。以上每完成一步驟后均用PBS液漂洗3次×5min/次。DAB顯色2～5min，封片，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取切片上5個不同的血腫周圍組織，計算陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

13 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS160版統(tǒng)計軟件包，結(jié)果用（x -±s）表示，采用成組設(shè)計資料的t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

21 實(shí)驗(yàn)大鼠的生理參數(shù)比較：本研究各組大鼠的平均動脈壓、血?dú)夥治?、紅細(xì)胞壓積、血糖等各項(xiàng)生理指標(biāo)變量，均在正常范圍，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）。

22 HBOP對大鼠腦出血72小時后神經(jīng)功能評分及腦水含量的影響：大鼠腦出血72小時后，HBOP組大鼠神經(jīng)功能評分與SP組相比顯著改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001），見表2。HBOP組大鼠血腫側(cè)基底節(jié)水含量顯著低于對照組（P<001），其他部位腦組織水含量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

23 HBOP減少大鼠腦出血72小時后血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡和PAR_1的表達(dá)：TUNEL法染色中典型細(xì)胞凋亡形態(tài)特征為胞體縮小，胞核濃染成棕色或棕黑色。本實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠腦出血后72小時，HBOP組大鼠血腫周圍腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)少于SP組[（1057±312）/mm2 vs （1886±244）/mm2，P<001]。免疫組化分析顯示腦出血周圍腦組織PAR_1表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)，HBOP組顯著少于SP組[（1583±267）/mm2 vs （2944±346）/mm2，P<001]。

24 PAR_AP對HBOP后出血周圍腦組織PAR_1的表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡、腦水含量以及神經(jīng)功能的影響：HBOP前腦內(nèi)給予PAR_AP顯著增加了HBOP大鼠腦出血72小時后血腫周圍腦組織PAR_1表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)[（2367±422）/mm2 vs （1713±337）/mm2，P<001]以及血腫周圍凋亡的神經(jīng)細(xì)胞[（1638±283）/mm2 vs （1175±291）/mm2，P<001]。PAR_AP增加了HBOP大鼠腦出血72小時后出血側(cè)基底節(jié)區(qū)腦水含量[（810±03） vs （805±04），P<005]。PAR_AP使HBOP大鼠腦出血72h后神經(jīng)功能也明顯惡化，見表4。

3 討論

1996年Wada[1]首次發(fā)現(xiàn)重復(fù)HBOP能顯著減輕沙土鼠海馬區(qū)神經(jīng)組織缺血后細(xì)胞損傷，這種現(xiàn)象稱為“腦缺血耐受”，此后多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)HBOP在肝臟、脊髓、心臟等器官均能誘導(dǎo)該現(xiàn)象[7，8]。Qin[3]等研究發(fā)現(xiàn)，HBOP能減輕大鼠腦出血后24h腦水腫，減少血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)作用。既往實(shí)驗(yàn)研究表明大鼠腦出血后腦內(nèi)水腫高峰期在出血后3～4天，腦組織損傷也最嚴(yán)重[9]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBOP顯著減輕大鼠腦出血72h時的腦水腫，血腫周圍的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與假預(yù)處理組比較也有下降，同時神經(jīng)功能顯著改善，提示HBOP減輕腦出血后腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡有一定的持續(xù)性。

腦出血后血液在凝固過程中產(chǎn)生的大量凝血酶具有細(xì)胞毒性作用，是出血后一系列病理生理變化而致繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵物質(zhì)[10]，凝血酶特異性抑制劑-水蛭素可以抑制PAR_1的表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。凝血酶受體是一種蛋白酶激活受體（PAR），PAR_1在腦內(nèi)分布最廣泛，腦出血后PAR_1在凝血酶介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中起主要作用。腦出血后，凝血酶的產(chǎn)生是一個持續(xù)性的過程，姜亞軍[11]等發(fā)現(xiàn)PAR_1的表達(dá)高峰與細(xì)胞凋亡和腦水腫的高峰一致，均在腦出血72h左右，提示PAR_1參與了腦出血后腦損傷的全過程。以往我們的體外研究也發(fā)現(xiàn)，凝血酶預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)元保護(hù)作用是通過PAR_1介導(dǎo)的，PAR_1激動劑可以模擬凝血酶預(yù)處理的作用[5]。PAR_1活化后激活細(xì)胞內(nèi)多個信號傳導(dǎo)通路，如激活RhoA、蛋白激酶C、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK），激活核內(nèi)蛋白合成酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)和釋放，加重腦水腫和繼發(fā)性腦損傷[4，12]。Gingrich[13]等的研究發(fā)現(xiàn)PAR_1介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制也可能涉及NMDA受體作用。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBOP可以降低腦出血后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞PAR_1的表達(dá)，預(yù)處理前尾狀核內(nèi)給予PAR_1激動劑，增加了血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞PAR_1的表達(dá)，抑制了HBOP誘導(dǎo)的減輕腦出血后腦水腫、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和改善神經(jīng)功能損害的神經(jīng)保護(hù)作用。這些結(jié)果提示了PAR_1水平的下調(diào)在HBOP誘導(dǎo)的腦保護(hù)作用中起到重要作用，是可能的機(jī)制之一。

綜上所述，HBOP可能通過下調(diào)PAR_1的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的激活，減少血腫周圍的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到減輕腦出血后腦水腫和改善神經(jīng)功能的作用。

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