韓娜娜， 金 華， 馬翔宇， 劉 艷， 張 潔

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科, 烏魯木齊 830011; 2中山大學(xué)藥學(xué)院， 廣州 510006)

新疆地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率及病死率一直居全國之首，近年來有逐漸年輕化趨勢。新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院10 a病案統(tǒng)計顯示，收治的各類惡性腫瘤中宮頸癌占18.9%，位居第1位。每年新收治的子宮頸癌約500例，其中維吾爾族婦女占70%～80%，特別是南疆維吾爾族婦女宮頸癌患病人數(shù)在全國少數(shù)民族中占第1位[1]。這種民族聚集性高發(fā)的現(xiàn)象提示，除環(huán)境致癌因素外，可能還存在遺傳易感性，因此有必要了解新疆維吾爾族婦女宮頸癌中與發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞分化、增殖及凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)情況。近年來研究發(fā)現(xiàn)，P53、胰島素樣生長因子-I (insulin like growth factors，IGF-I)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、 Bcl-2和Bax與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)[2]。本研究選取新疆宮頸癌高發(fā)人群維吾爾族婦女宮頸病變樣本資源，在mRNA和蛋白表達(dá)水平對P53、IGF-I、VEGF及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax在宮頸癌中的表達(dá)、分布為切入點，探討新疆維吾爾族婦女宮頸癌的高發(fā)機(jī)制，并試圖為本地區(qū)宮頸癌的早期診斷、判斷預(yù)后尋找有效的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1研究對象選取2012年10月-2013年6月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科收治的維吾爾族婦女浸潤性宮頸癌(Invasive Cervical Cancer，ICC)組織38例作為宮頸癌組，以同期新疆維吾爾族婦女良性病變行子宮切除患者正常或者慢性宮頸炎組織32例作為正常對照組。年齡27～58 歲，中位年齡(48.32±7.65)歲。納入病例時排除已接受過腫瘤手術(shù)切除或放化療的患者，同時排除患有子宮切除或骨盆放射治療史、其他惡性腫瘤以及呼吸系統(tǒng)、心血管和代謝性疾病等其他嚴(yán)重疾病的患者。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，并且患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器Trizol 試劑(美國 Invitrogen公司)，熒光定量 PCR 試劑盒、dNTPs 及逆轉(zhuǎn)錄酶 (北京康潤生物公司)，ABI Prism 7500 熒光定量 PCR 儀(美國 ABI 公司)。P53、IGF-I、VEGF、Bcl-2和Bax特異性單克隆抗體(Santa Cruz 和Anbobio公司)，酶標(biāo)二抗和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3實時熒光定量PCR(RTFQ-PCR)檢測

1.3.1 引物設(shè)計合成 由NCBI基因庫獲知人類表皮生長因子受體-2(HER-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、IGF-I、VEGF和內(nèi)參照GAPDH基因的序列，按照原則設(shè)計和擴(kuò)增6種基因的引物，引物由北京康潤生物合成。實時熒光定量PCR引物的序列見表1。

表1 引物設(shè)計序列

1.3.2 RNA提取、cDNA合成和熒光定量PCR反應(yīng) 采用Trizol法提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系: 擴(kuò)增條件：94℃ 2 min熱變性后, 進(jìn)行40個循環(huán)，94℃ 30 s, 55℃30 s, 72℃延伸(1 min/kb),72℃延伸7 min。熒光定量PCR儀擴(kuò)增并采集數(shù)據(jù)，根據(jù)數(shù)據(jù)分別繪制2種樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4蛋白免疫印跡選擇兩組在RTFQ-PCR結(jié)果中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的基因，對其蛋白的表達(dá)含量進(jìn)行測定。取宮頸組織0.5 g，剪碎加入細(xì)胞裂解液, 勻漿裂解40 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清液進(jìn)行蛋白定量 (BCA法)。取40 μg總蛋白進(jìn)行12.5%變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移，麗春紅S染色，封閉非特異性的結(jié)合位點，TBST洗膜，加入預(yù)測蛋白的一抗孵育1 h。TBST 洗膜后加入結(jié)合有辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔的IgG 二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，資料分析采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1熒光定量結(jié)果與正常對照組(mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)為1)比較，宮頸癌組患者宮頸組織中IGF-I、VEGF 和Bcl-2表達(dá)均有不同程度的升高，P53、Bax表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2蛋白免疫印跡結(jié)果與正常對照組比較， 宮頸癌組患者宮頸組織中VEGF、Bcl-2表達(dá)均有不同程度的升高，P53、Bax表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而兩組IGF-I蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2、3。

2.3兩組Bcl-2/Bax值比較結(jié)果與正常對照組比較，在mRNA和蛋白質(zhì)水平，宮頸癌組Bcl-2表達(dá)均明顯升高，而Bax表達(dá)均明顯下降，Bcl-2/Bax值顯著升高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種因素作用的結(jié)果，有內(nèi)因也有外因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中總要涉及細(xì)胞的增生分化、凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控、信號傳導(dǎo)以及腫瘤中血管的生成等，與很多細(xì)胞因子有關(guān)，有的參與細(xì)胞的增生分化；有的參與細(xì)胞周期的調(diào)控；有的與血管的生成有關(guān)，或者同時有多種功能并相互作用。

本研究選取與腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的P53、IGF-I、VEGF 和Bcl-2 、Bax 5個因子，檢測了其在維吾爾族婦女宮頸癌組織中的表達(dá)變化，從整體水平篩查與子宮頸癌發(fā)生相關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)，對維吾爾族宮頸癌的早期診斷及篩選治療靶點等具有重要的意義。

P53基因位于17號染色體，是重要的抑癌基因，分為野生型和突變型，野生型抗腫瘤的作用主要是阻止G1/G0期，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖[3]。突變是人類腫瘤最常見的基因改變之一，在200多種不同的腫瘤中有50% 的腫瘤帶有P53 基因突變,P53 基因的缺乏還能導(dǎo)致早期大量腫瘤的發(fā)生。齊朝陽等[4]報道了P53 基因突變及P53 蛋白過量表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系。在一定的條件下，P53 基因是“基因衛(wèi)士”，而在條件改變后，又可以轉(zhuǎn)化為“基因殺手”。也就是說，P53基因發(fā)生突變，可導(dǎo)致穩(wěn)定蛋白不能完成抑制細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化，腫瘤侵襲性增強(qiáng)，使得P53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)化為原癌基因，突變的P53失去抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4]。本研究使用熒光定量PCR(RTFQ-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)技術(shù)檢測宮頸癌組織及正常宮頸組織中的P53在mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明P53基因突變在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

IGF-I調(diào)控腫瘤的可能途徑是抑制凋亡。細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)，受各種凋亡基因的調(diào)控，包括內(nèi)源性和外源性2種機(jī)制。IGF-Ⅰ是一類具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及血管形成等多種生物活性的多肽生長因子，其與多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。 有研究顯示，IGF-I可以明顯提高腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子( VEGF )的表達(dá), 促進(jìn)腫瘤血管的形成及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移； ICG-I在促進(jìn)腫瘤新生血管形成和腫瘤生長轉(zhuǎn)移中起重要作用[6]，而阻斷這些環(huán)節(jié)有可能成為治療宮頸癌新的靶點之一。本研究表明,在mRNA表達(dá)水平，IGF-I在宮頸癌患者宮頸組織中表達(dá)升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在蛋白水平表達(dá)中，兩組IGF-I表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

VEGF是一種與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的肝素結(jié)合糖蛋白，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管形成因子之一，也是腫瘤細(xì)胞分泌的血管形成因子中最重要的一種[7]。其能促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)微血管通透性，增加腫瘤細(xì)胞氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供給，并為腫瘤細(xì)胞脫落和基質(zhì)擴(kuò)散創(chuàng)造條件。 目前研究發(fā)現(xiàn)VEGF在腫瘤組織中高表達(dá)，不但促進(jìn)腫瘤的血管形成，并且與宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，VEGF在宮頸癌患者宮頸組織中表達(dá)升高，在mRNA和蛋白表達(dá)水平中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，證實VEGF與宮頸癌關(guān)系密切。

Bcl-2是Bcl-2基因家族中的原癌基因之一，包括凋亡前體蛋白及生存前體蛋白成員，對內(nèi)源性細(xì)胞死亡途徑至關(guān)重要，可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，與其他癌基因如P53等共同控制著細(xì)胞的生長、分化、增生和凋亡[9]。而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。本研究分別檢測了Bcl-2和Bax這2種凋亡關(guān)鍵因子，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，在mRNA和蛋白水平，Bcl-2在宮頸癌組織中的表達(dá)均明顯升高，而Bax的表達(dá)均明顯下降，Bcl-2/Bax值顯著升高(P<0.05)。其在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)，而促凋亡因子Bax呈低表達(dá)。由于細(xì)胞死亡的易感性受控于胞質(zhì)內(nèi)Bcl-2和Bax間的平衡，Bcl-2/Bax比值增大使細(xì)胞凋亡過度抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞以絕對的優(yōu)勢獲得生長，并對凋亡信號不再敏感，這種“一邊倒”的生長模式打破了正常細(xì)胞的凋亡機(jī)制，使得腫瘤細(xì)胞不斷發(fā)展、惡化[10]。

研究表明，惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、漸進(jìn)累積的復(fù)雜過程，在此過程中機(jī)體和細(xì)胞發(fā)生了許多重要改變，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、腫瘤血管形成等，它也是轉(zhuǎn)移中的腫瘤“分子進(jìn)化”的過程[11]。隨著研究的深入，人們將揭示出P53、IGF-I、VEGF及凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax在惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中具體作用機(jī)制，探討其與宮頸癌的關(guān)系及可能存在的差異，對闡釋新疆維吾爾族婦女宮頸癌的早期診斷和治療提供有力的理論依據(jù)。本研究臨床例數(shù)尚少，其關(guān)系還需進(jìn)一步的大量臨床研究加以佐證。

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱曉燕，邱杰，賴曉軍.新疆腫瘤醫(yī)院10年住院病人惡性腫瘤分布特征[J].中國腫瘤，2004，13(11)：712-714.

[2] 高進(jìn),章靜波.癌的侵襲與轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)與臨床[M].北京:科學(xué)出版社,2003:349-350.

[3] Remacle-Bonnet MM,Garrouste FL,Heller S, et al.Insulin-like growth factor-I protects colon cancer cells form death factor-induced apoptosis by potentiating tumor necrosis factor a induced mitogenactivated protein kinase and nuclear factor signaling pathways[J].Cancer Res,2010,60(7):2007.

[4] 齊朝陽，陳艷，曾鴻,等.宮頸上皮內(nèi)腫瘤P16、P53、Ki67、P63的表達(dá)與HPV感染及其臨床意義 [J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(20)：3638-3640.

[5] Kojima S, Inahara M, Suzuki H, et al. Implications of insulin-like growth factor-I for prostate cancer therapies[J]. Int J Urol,2009, 16(2):161-167.

[6] Hakam A,Yeatman TJ,Lu L,et al.Expression of insulin-like growth factor-I receptor in human colorectal cancer [J].Human Pathol,2003,30(10):11.

[7] Reinmuth N,Fan F,Liu W,et al.Impact of insulin-like growth factor receptor-I function on angiogenesis,growth and metastasis of colon cancer[J].Lab Invest,2009,82(10):1377-1389.

[8] 方旭.細(xì)胞角質(zhì)蛋白和血管內(nèi)皮生長因子在早期宮頸癌中的表達(dá)及意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2010,26(18)：3347-3350.

[9] 曾文,田俊波,肖建華,等.Bcl-2抑制劑研究進(jìn)展[J].實用醫(yī)學(xué)雜志 ，2013,29(4)：665-666.

[10] Chiu TL, Su CC.Curcumin inhibits proliferation and migration by increasing the Bax to Bcl-2 ratio and decreasing NF-kappaBp65 expression in breast cancer MDA-MB-231 cells[J]. Int J Mol Med, 2009,23(4):469-475.

[11] Wilson J, Balkwill F. The role of cytokines in the epithelial cancer microenvironment[J]. Semin Cancer Biol,2002, 12(2):113-120.