鄒芝英等

摘要：以吉富羅非魚的外周血細(xì)胞為樣本、小鼠淋巴細(xì)胞DNA為標(biāo)準(zhǔn)（7.0 pg/2C），采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合內(nèi)標(biāo)法測定血細(xì)胞的核DNA含量。結(jié)果顯示：吉富羅非魚的核DNA含量為小鼠淋巴細(xì)胞的0.339 2±0.009 0倍，絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

關(guān)鍵詞：吉富羅非魚；流式細(xì)胞術(shù)；DNA含量

中圖分類號： S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0036-03

羅非魚（Tilapia），俗稱非洲鯽魚，以其生長快、食性雜和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)勢成為國際上養(yǎng)殖最廣泛的品種之一，是國際貿(mào)易第三大水產(chǎn)品。中國的羅非魚產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的一半，其出口量高居世界第一位[1]。吉富品系尼羅羅非魚（genetically improved farmed Tilapia Oreochromis niloticus，GIFT，簡稱吉富羅非魚）是中國主要養(yǎng)殖的羅非魚品種（系）之一，也是中國養(yǎng)殖的羅非魚品種中生長最快的品種（系）之一。吉富羅非魚是由國際水生生物資源管理中心、挪威水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所和菲律賓的一些國家級研究機(jī)構(gòu)通過對4個(gè)非洲原產(chǎn)地（埃及、加納、肯尼亞、塞內(nèi)加爾）直接引進(jìn)的尼羅羅非魚品系和4個(gè)在亞洲地區(qū)（以色列、新加坡、泰國、中國臺灣）廣泛養(yǎng)殖的尼羅羅非魚品系進(jìn)行混合選育進(jìn)而獲得的優(yōu)良品系[2]。經(jīng)過近20年的種內(nèi)群體間雜交和選育，該品系已經(jīng)顯示出優(yōu)越的生長優(yōu)勢和潛能[3-4]，引起了亞太地區(qū)的廣泛興趣和關(guān)注，多個(gè)國家進(jìn)行了引種并啟動(dòng)了對其進(jìn)一步改良和推廣的國家育種計(jì)劃[5]。為了促進(jìn)中國羅非魚養(yǎng)殖持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展，2006年8月世界漁業(yè)中心向中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心輸送了60個(gè)家系的吉富羅非魚，以期在中國進(jìn)行吉富羅非魚的選育和推廣工作，這是中國第一次引進(jìn)如此多家系的吉富羅非魚。目前研究人員已經(jīng)對該群體進(jìn)行了連續(xù)3代的家系選育，同時(shí)開展了對不同家系的生長性能[6-7]、遺傳多樣性[8-9]等方面的評估工作。

脫氧核糖核酸（DNA）是絕大多數(shù)生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，一個(gè)細(xì)胞核中所含的DNA總量對于某物種是一定的。生物DNA含量的研究不但是研究物種間差別的重要方法，而且對分類和系統(tǒng)演化的探討、物種進(jìn)化研究等具有參考意義，同時(shí)也是種質(zhì)資源和種質(zhì)質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)對我國新引進(jìn)的吉富羅非魚群體中的DNA含量進(jìn)行測定，以期為吉富羅非魚的人工選育和種質(zhì)資源評價(jià)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用吉富羅非魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，為同一批繁殖的苗種。將所有的魚在重量為20 g左右時(shí)進(jìn)行PIT（passive tntegrated transponder）標(biāo)記，然后在同一池塘內(nèi)養(yǎng)殖300 d，再測定每尾魚的體質(zhì)量、體長、體高、體厚等，并計(jì)算300 d的增重。從試驗(yàn)用羅非魚中隨機(jī)抽取其3個(gè)家系（A、B、C），A家系13尾，B、C家系各15尾，共43尾，分別記為A1～A13、B1～B15、C1～C15；其中雌魚20尾，雄魚23尾。試驗(yàn)用昆明種小白鼠由衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所惠贈。

1.1.2 儀器與試劑 FACSCalibur流式細(xì)胞儀，BD公司。碘化丙啶（propidiamiodide，PI）購自 Sigma 公司；RNase購自 Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單細(xì)胞懸液的制備及固定 取4周齡的昆明種小白鼠，斷頸處死后剖腹，剪開胸骨，可見心臟上方灰白色柔軟的組織塊，即胸腺。分離周圍組織，取下胸腺并用PBS清洗。輕壓組織塊得渾濁的液體，用200 μm細(xì)胞篩過濾，即得單細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心15 min后棄上清，加PBS緩沖液重懸沉淀物并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度，使加入的預(yù)冷100%乙醇變?yōu)?0%濃度時(shí)，淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為106個(gè)/mL。-20 ℃ 固定過夜或者冷藏待用。

從試驗(yàn)魚尾靜脈取約0.5 mL血（用ACD抗凝劑濕潤注射器，以防凝固），嚴(yán)防溶血。4 ℃靜置過夜后用PBS緩沖液將魚血稀釋，清洗1次后重懸于PBS溶液中并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。加入預(yù)冷的70%乙醇-PBS混合液，并調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL，-20 ℃固定過夜或者冷藏待用。

1.2.2 PI染色 分別取0.5 mL小鼠淋巴細(xì)胞固定液和魚血固定液，混合、離心去除固定液后用PBS緩沖液清洗1次，重懸于1 mL的PI-PBS（PI濃度為50 μg/mL）染色液中，加入2 μL 100 mg/μL RNase，避光孵育 0.5 h后過200 μm細(xì)胞篩，上機(jī)檢測。

1.2.3 樣品檢測 采用 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀測定各樣品的熒光密度值（PI fluorescence），流速控制在低速（12 μL/min），每次檢測10 000個(gè)細(xì)胞。由流式細(xì)胞儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件CELLQuest Pro自動(dòng)計(jì)算每次檢測樣品的平均熒光密度值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每次檢測樣品的細(xì)胞核DNA含量依照以下公式計(jì)算：P1=E2/E1×P2。式中：P1表示魚血細(xì)胞的DNA含量，pg；P2表示對照小鼠細(xì)胞的DNA含量，pg；E1表示魚血細(xì)胞的平均熒光密度值；E2表示雞血細(xì)胞的平均熒光密度值。小鼠淋巴細(xì)胞的DNA絕對含量以7.0 pg/2C為標(biāo)準(zhǔn)[10]。用流式細(xì)胞儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件ModFit軟件分析細(xì)胞周期。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用 SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉富羅非魚的細(xì)胞周期

吉富羅非魚細(xì)胞與小鼠淋巴細(xì)胞的熒光密度峰的相對位置見圖1。ModFit軟件分析表明，小鼠淋巴細(xì)胞的熒光密度峰（M2）只有1個(gè)G0/G1峰，不表現(xiàn)出細(xì)胞周期現(xiàn)象；吉富羅非魚的紅細(xì)胞存在2個(gè)熒光密度峰，第1個(gè)峰值（M1）約占95%左右，為G0/G1期細(xì)胞；G0/G1峰值后是1段比例很小的峰谷，約占3.5%左右，為S期；緊接著又有1段峰值約為25%的G2期和M期。

2.2 吉富羅非魚的細(xì)胞核DNA含量

采用流式細(xì)胞儀對吉富羅非魚的血細(xì)胞DNA含量進(jìn)行了測定，詳見圖1、表1?？梢钥闯黾涣_非魚血細(xì)胞的平均熒光密度值為200.33±11.260 2，小鼠淋巴細(xì)胞的平均熒光密度值為590.50±28.302 9，兩者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴細(xì)胞DNA的絕對含量值7.0 pg/2C作為標(biāo)準(zhǔn)，可以算出吉富羅非魚的血細(xì)胞DNA絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

3 討論

研究魚類的種質(zhì)參數(shù)、掌握該魚的種質(zhì)特征對于人工育種都具有一定的指導(dǎo)意義。DNA含量分析是種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的參數(shù)之一。近年來測定魚類細(xì)胞DNA含量的方法主要是采用顯微分光光度計(jì)和流式細(xì)胞儀2種方法[11]，從目前的技術(shù)水平來看，采用流式細(xì)胞儀測定魚類DNA含量要比采用顯微分光光度計(jì)法更準(zhǔn)確些。流式細(xì)胞儀是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細(xì)胞大小、DNA/RNA、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等）進(jìn)行相關(guān)檢測分析的高技術(shù)儀器，具有快速、準(zhǔn)確、采集數(shù)據(jù)量大（速度可達(dá)1 000～10 000個(gè)/s）、分析全面和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛運(yùn)用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性的檢測中[12-14]。到目前為止，用流式細(xì)胞儀測定魚類細(xì)胞含量的方法已比較完善和普遍。此外，流式細(xì)胞儀對樣品需求量少，只需要微量魚血即可，使得對試驗(yàn)魚的傷害減至最低。

對于同一種生物而言，體細(xì)胞的DNA含量是恒定的，具有種的特征，在親緣關(guān)系相近的類群中可以作為探討其演化地位和親緣關(guān)系的依據(jù)[13]。吳洪喜等測定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）與魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明兩者之間的親緣關(guān)系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量則稍高于毛蚶和魁蚶，因此認(rèn)為泥蚶在進(jìn)化程度上與毛蚶和魁蚶相近且比它們要高級[14]。方旅平等研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）與刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）DNA含量的絕對值相差不大，因而推知這2種蝦在系統(tǒng)發(fā)生上具有相近的親緣關(guān)系，這與形態(tài)學(xué)上的分類系統(tǒng)是一致的[15]。顧若波等研究發(fā)現(xiàn)，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的細(xì)胞核DNA含量與同亞科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本試驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)測得吉富羅非魚血細(xì)胞核DNA含量為（2.374 5±0.063 0）pg/2C，與已報(bào)道的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奧利亞羅非魚（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲紅魚（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，這與4種羅非魚親緣關(guān)系接近是一致的。

常見的參照標(biāo)準(zhǔn)有雞血細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、小鼠淋巴細(xì)胞、鱉血細(xì)胞、鱒魚紅細(xì)胞及鮭魚紅細(xì)胞等[11]。雞血細(xì)胞具有來源豐富、著色性好、大小均勻等優(yōu)點(diǎn)，并且在大量研究中被廣泛應(yīng)用，而且雞血細(xì)胞與羅非魚的DNA含量相近，比值接近[17]。采用內(nèi)標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚細(xì)胞與小鼠淋巴細(xì)胞的熒光密度峰值相近，不易區(qū)分，如果對照品和測試樣品分別上機(jī)檢測即采用外標(biāo)法檢測時(shí)，有可能出現(xiàn)一定的誤差。許曉軍等報(bào)道采用內(nèi)標(biāo)法獲得的檢測結(jié)果變異系數(shù)小于外標(biāo)法，并建議選取DNA含量相差較大的物種作為參照標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此本試驗(yàn)選取小鼠淋巴細(xì)胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)標(biāo)法測定吉富羅非魚的細(xì)胞核DNA含量。

參考文獻(xiàn)：

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2.2 吉富羅非魚的細(xì)胞核DNA含量

采用流式細(xì)胞儀對吉富羅非魚的血細(xì)胞DNA含量進(jìn)行了測定，詳見圖1、表1。可以看出吉富羅非魚血細(xì)胞的平均熒光密度值為200.33±11.260 2，小鼠淋巴細(xì)胞的平均熒光密度值為590.50±28.302 9，兩者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴細(xì)胞DNA的絕對含量值7.0 pg/2C作為標(biāo)準(zhǔn)，可以算出吉富羅非魚的血細(xì)胞DNA絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

3 討論

研究魚類的種質(zhì)參數(shù)、掌握該魚的種質(zhì)特征對于人工育種都具有一定的指導(dǎo)意義。DNA含量分析是種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的參數(shù)之一。近年來測定魚類細(xì)胞DNA含量的方法主要是采用顯微分光光度計(jì)和流式細(xì)胞儀2種方法[11]，從目前的技術(shù)水平來看，采用流式細(xì)胞儀測定魚類DNA含量要比采用顯微分光光度計(jì)法更準(zhǔn)確些。流式細(xì)胞儀是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細(xì)胞大小、DNA/RNA、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等）進(jìn)行相關(guān)檢測分析的高技術(shù)儀器，具有快速、準(zhǔn)確、采集數(shù)據(jù)量大（速度可達(dá)1 000～10 000個(gè)/s）、分析全面和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛運(yùn)用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性的檢測中[12-14]。到目前為止，用流式細(xì)胞儀測定魚類細(xì)胞含量的方法已比較完善和普遍。此外，流式細(xì)胞儀對樣品需求量少，只需要微量魚血即可，使得對試驗(yàn)魚的傷害減至最低。

對于同一種生物而言，體細(xì)胞的DNA含量是恒定的，具有種的特征，在親緣關(guān)系相近的類群中可以作為探討其演化地位和親緣關(guān)系的依據(jù)[13]。吳洪喜等測定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）與魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明兩者之間的親緣關(guān)系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量則稍高于毛蚶和魁蚶，因此認(rèn)為泥蚶在進(jìn)化程度上與毛蚶和魁蚶相近且比它們要高級[14]。方旅平等研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）與刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）DNA含量的絕對值相差不大，因而推知這2種蝦在系統(tǒng)發(fā)生上具有相近的親緣關(guān)系，這與形態(tài)學(xué)上的分類系統(tǒng)是一致的[15]。顧若波等研究發(fā)現(xiàn)，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的細(xì)胞核DNA含量與同亞科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本試驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)測得吉富羅非魚血細(xì)胞核DNA含量為（2.374 5±0.063 0）pg/2C，與已報(bào)道的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奧利亞羅非魚（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲紅魚（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，這與4種羅非魚親緣關(guān)系接近是一致的。

常見的參照標(biāo)準(zhǔn)有雞血細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、小鼠淋巴細(xì)胞、鱉血細(xì)胞、鱒魚紅細(xì)胞及鮭魚紅細(xì)胞等[11]。雞血細(xì)胞具有來源豐富、著色性好、大小均勻等優(yōu)點(diǎn)，并且在大量研究中被廣泛應(yīng)用，而且雞血細(xì)胞與羅非魚的DNA含量相近，比值接近[17]。采用內(nèi)標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚細(xì)胞與小鼠淋巴細(xì)胞的熒光密度峰值相近，不易區(qū)分，如果對照品和測試樣品分別上機(jī)檢測即采用外標(biāo)法檢測時(shí)，有可能出現(xiàn)一定的誤差。許曉軍等報(bào)道采用內(nèi)標(biāo)法獲得的檢測結(jié)果變異系數(shù)小于外標(biāo)法，并建議選取DNA含量相差較大的物種作為參照標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此本試驗(yàn)選取小鼠淋巴細(xì)胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)標(biāo)法測定吉富羅非魚的細(xì)胞核DNA含量。

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2.2 吉富羅非魚的細(xì)胞核DNA含量

采用流式細(xì)胞儀對吉富羅非魚的血細(xì)胞DNA含量進(jìn)行了測定，詳見圖1、表1?？梢钥闯黾涣_非魚血細(xì)胞的平均熒光密度值為200.33±11.260 2，小鼠淋巴細(xì)胞的平均熒光密度值為590.50±28.302 9，兩者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴細(xì)胞DNA的絕對含量值7.0 pg/2C作為標(biāo)準(zhǔn)，可以算出吉富羅非魚的血細(xì)胞DNA絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

3 討論

研究魚類的種質(zhì)參數(shù)、掌握該魚的種質(zhì)特征對于人工育種都具有一定的指導(dǎo)意義。DNA含量分析是種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的參數(shù)之一。近年來測定魚類細(xì)胞DNA含量的方法主要是采用顯微分光光度計(jì)和流式細(xì)胞儀2種方法[11]，從目前的技術(shù)水平來看，采用流式細(xì)胞儀測定魚類DNA含量要比采用顯微分光光度計(jì)法更準(zhǔn)確些。流式細(xì)胞儀是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細(xì)胞大小、DNA/RNA、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等）進(jìn)行相關(guān)檢測分析的高技術(shù)儀器，具有快速、準(zhǔn)確、采集數(shù)據(jù)量大（速度可達(dá)1 000～10 000個(gè)/s）、分析全面和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛運(yùn)用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性的檢測中[12-14]。到目前為止，用流式細(xì)胞儀測定魚類細(xì)胞含量的方法已比較完善和普遍。此外，流式細(xì)胞儀對樣品需求量少，只需要微量魚血即可，使得對試驗(yàn)魚的傷害減至最低。

對于同一種生物而言，體細(xì)胞的DNA含量是恒定的，具有種的特征，在親緣關(guān)系相近的類群中可以作為探討其演化地位和親緣關(guān)系的依據(jù)[13]。吳洪喜等測定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）與魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明兩者之間的親緣關(guān)系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量則稍高于毛蚶和魁蚶，因此認(rèn)為泥蚶在進(jìn)化程度上與毛蚶和魁蚶相近且比它們要高級[14]。方旅平等研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）與刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）DNA含量的絕對值相差不大，因而推知這2種蝦在系統(tǒng)發(fā)生上具有相近的親緣關(guān)系，這與形態(tài)學(xué)上的分類系統(tǒng)是一致的[15]。顧若波等研究發(fā)現(xiàn)，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的細(xì)胞核DNA含量與同亞科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本試驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)測得吉富羅非魚血細(xì)胞核DNA含量為（2.374 5±0.063 0）pg/2C，與已報(bào)道的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奧利亞羅非魚（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲紅魚（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，這與4種羅非魚親緣關(guān)系接近是一致的。

常見的參照標(biāo)準(zhǔn)有雞血細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、小鼠淋巴細(xì)胞、鱉血細(xì)胞、鱒魚紅細(xì)胞及鮭魚紅細(xì)胞等[11]。雞血細(xì)胞具有來源豐富、著色性好、大小均勻等優(yōu)點(diǎn)，并且在大量研究中被廣泛應(yīng)用，而且雞血細(xì)胞與羅非魚的DNA含量相近，比值接近[17]。采用內(nèi)標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚細(xì)胞與小鼠淋巴細(xì)胞的熒光密度峰值相近，不易區(qū)分，如果對照品和測試樣品分別上機(jī)檢測即采用外標(biāo)法檢測時(shí)，有可能出現(xiàn)一定的誤差。許曉軍等報(bào)道采用內(nèi)標(biāo)法獲得的檢測結(jié)果變異系數(shù)小于外標(biāo)法，并建議選取DNA含量相差較大的物種作為參照標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此本試驗(yàn)選取小鼠淋巴細(xì)胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)標(biāo)法測定吉富羅非魚的細(xì)胞核DNA含量。

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