齊奇，劉河濤，楊文君，王銀，余建強(qiáng)

(寧夏醫(yī)科大學(xué) a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；b.藥學(xué)院，銀川 750004)

0 引 言

牛乳中含有大量的蛋白質(zhì),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為牛乳的3.3%～3.5%。主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類,其中酪蛋白占78.8%，酪蛋白經(jīng)酶促水解后可以產(chǎn)生相應(yīng)的產(chǎn)物——胰酪胨[1]。胰酪胨，又稱胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein)，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白胨，含有豐富的氮源、氨基酸等，是微生物培養(yǎng)基關(guān)鍵原材料之一，能用于任何需要酪蛋白的胰酶或胰蛋白酶水解產(chǎn)物的配方之中，用于細(xì)菌的培養(yǎng)、分離、增殖、鑒定，以及無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基等細(xì)菌生化特性試驗(yàn)用培養(yǎng)基的配置。特別是由于富含色氨酸可用于吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)要求較高的生物培養(yǎng)基[2-3]。

本研究中采用當(dāng)?shù)厮a(chǎn)鮮牛奶經(jīng)過(guò)等電點(diǎn)沉淀、洗滌、脫脂和凍干后生產(chǎn)的酪蛋白作為反應(yīng)底物，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶水解后得到胰酪胨。分別研究pH值、反應(yīng)時(shí)間、水解溫度和酶與底物的濃度比對(duì)胰蛋白酶水解效率的影響，通過(guò)L9(34)正交表排列優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期達(dá)到提高酪蛋白原料的利用率。同時(shí)亦獲得成本較低、水解度高、氨基酸及其他各項(xiàng)理化性質(zhì)達(dá)標(biāo)的胰酪胨產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶，胰蛋白酶，酪蛋白，胰酪胨標(biāo)準(zhǔn)品，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度儀，L-8800型氨基酸分析儀，PowerDry LL3000凍干機(jī)，AnkeTDL-S-A臺(tái)式離心機(jī)，DK-s24恒溫水浴箱，Z-2000原子吸收光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的制備

(1)酪蛋白制備工藝流程

新鮮牛奶→等電點(diǎn)沉淀蛋白→離心洗滌(15 min，3 000 r/min)→抽濾洗滌→乙醚、乙醇脫脂→凍干

(2)酪蛋白制備工藝的參數(shù)確定[4-7]。為確定等電點(diǎn)法制備胰酪胨的最佳工藝條件，以100 mL經(jīng)巴氏消毒后的鮮牛奶為原材料設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行制備。固定其他條件，分別考察提取溫度(40，45，50，55，60 ℃)，pH值(4.3，4.5，4.7，4.9，5.1)對(duì)提取效果的影響。

(3)酪蛋白純度采用雙縮脲法測(cè)定。

1.3.2 胰酪胨的制備

1.3.2.1 胰酪胨制備工藝流程[8-11]

酪蛋白→加水后加熱90℃保持30 min→調(diào)節(jié)pH，溫度后加入胰蛋白酶→保持pH值，溫度消化2 h→加入胰蛋白酶，保持pH值溫度酶解1 h→加入胰蛋白酶，保持pH值溫度酶解1 h→加入冰醋酸，同時(shí)加入活性炭，95℃以上攪拌15 min→過(guò)濾后干燥→胰酪胨

1.3.2.2 胰酪胨制備工藝要點(diǎn)[12-17]

為確定胰蛋白酶水解制備胰酪胨最佳工藝條件，根據(jù)胰蛋白酶水解工藝設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平，以水解度和氨基氮為考察指標(biāo)，對(duì)水解溫度、水解pH值、水解時(shí)間以及酶濃度和底物濃度比(E/S)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.3.3 理化性質(zhì)檢測(cè)方法[18-19]

為確定根據(jù)以上工藝條件制備出的胰酪胨完全符合市售胰酪胨產(chǎn)品理化指標(biāo)要求，分別對(duì)其各項(xiàng)理化性質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。

(1)水解度(DH)的測(cè)定水解度采用pH-STAT法。

(2)氨基氮測(cè)定采用甲醛滴定法。

氨基氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＝滴定用標(biāo)準(zhǔn)堿毫升數(shù)×堿濃度×1.4／樣品質(zhì)量。

(3)總脂、水分、灰分和總氮的測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn) GB/T5009.5-2003，GB/T5009.10-2003，GB/T5009.3-2003，GB/T5009.4-2003中進(jìn)行。

(4)氨基酸的測(cè)定方法采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18246-2000進(jìn)行。

(5)胰酪胨所含蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)采用BCA法測(cè)定。

(6)微量元素測(cè)定采用原子吸收法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白制備單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值對(duì)酪蛋白制備結(jié)果的影響

將100 mL經(jīng)過(guò)巴氏消毒后的鮮牛奶預(yù)熱至45℃時(shí)， 分別加入pH值為4.3，4.5，4.7，4.9和5.1的濃度為0.2 mol/L的醋酸——醋酸鈉緩沖液中沉淀10 min，后經(jīng)過(guò)排除乳清、水洗滌、脫脂和烘干得出酪蛋白，并檢測(cè)酪蛋白產(chǎn)率和酪蛋白純度。

由圖1可以看出，在溫度和提取時(shí)間固定的情況下，當(dāng)pH值在4.7時(shí)，酪蛋白的產(chǎn)量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白純度相差不大。

圖1 pH值對(duì)酪蛋白制備結(jié)果的影響

2.1.2 溫度對(duì)酪蛋白制備結(jié)果的影響

將100 mL經(jīng)過(guò)巴氏消毒后的鮮牛奶分別預(yù)熱至40，45，50，55 ℃和60 ℃時(shí)， 分別加入pH值為4.7濃度為0.2 mol/L的醋酸——醋酸鈉緩沖液中沉淀10 min，后經(jīng)過(guò)排除乳清、水洗滌、脫脂和烘干得出酪蛋白，并檢測(cè)酪蛋白產(chǎn)率和酪蛋白純度。

圖2 溫度對(duì)酪蛋白制備結(jié)果的影響

由圖2可以看出，在pH值和提取時(shí)間固定的情況下，當(dāng)溫度在40℃時(shí)，酪蛋白的產(chǎn)量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白純度相差不大。

2.2 胰蛋白酶水解制備胰酪胨工藝正交實(shí)驗(yàn)2.2.1 以水解度為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[20-21]

以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2可得出，以水解度為指標(biāo)，胰蛋白酶水解酪蛋白最佳條件為A2B2C3D1，即pH值為8.0，溫度50℃，水解時(shí)間2.5h，E/S為0.24，此時(shí)水解度達(dá)44.4%。根據(jù)極差分析各因素的影響順序?yàn)閜H值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞E/S。

2.2.2 以氨基氮為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)

以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以氨基氮為指標(biāo)，表示的是制備出的胰酪胨中所含的在微生物生長(zhǎng)初期可以被快速利用的營(yíng)養(yǎng)成分含量，培養(yǎng)基中氨基氮的含量直接決定了培養(yǎng)基中能被微生物吸收的氮源含量。由表3可以看出，處于A1B1C3D3，即pH值為8.0，溫度40 ℃，水解時(shí)間1.5 h，E/S為0.32，此時(shí)氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到4.5%。根據(jù)極差分析得出各因素的影響順序?yàn)閜H值＞酶解溫度＞E/S＞酶解時(shí)間。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

以水解度為指標(biāo)，得出制備胰酪胨的最佳條件為A2B2C3D1；以產(chǎn)物中氨基氮為指標(biāo)，得出的制備最佳條件為A1B1C3D3。分別對(duì)工藝組合A2B2C3D1和A1B1C3D3進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，確定胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳條件。在工藝組合A2B2C3D1中，平均水解度為43.68%，氨基氮為4.47%；而在工藝組合A1B1C3D3中，平均水解度為41.79%，氨基氮為4.52%。因此確定胰蛋白酶水解酪蛋白制備胰酪胨的最佳工藝條件為A2B2C3D1，即pH值為 8.0，溫度50℃，水解時(shí)間2.5 h，E/S為0.24。

2.3 胰酪胨理化性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

參照國(guó)內(nèi)蛋白胨質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外OXOID有關(guān)蛋白胨質(zhì)量指標(biāo)，將根據(jù)工藝條件A2B2C3D1制備出的胰酪胨進(jìn)行理化指標(biāo)的分析檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，經(jīng)過(guò)以上工藝流程制備出的胰酪胨與OXOID生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品相比，各項(xiàng)理化指標(biāo)接近。實(shí)驗(yàn)制備的胰酪胨經(jīng)過(guò)檢測(cè)，總氮量與酪蛋白純度有關(guān)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)相近。因此在制備胰酪胨時(shí)，酪蛋白選擇很重要?？偭住⒖傊?、灰分的測(cè)定結(jié)果都小于標(biāo)準(zhǔn)品，其中總脂小于標(biāo)準(zhǔn)品是因?yàn)槲覀兘o樣品采用了脫脂的實(shí)驗(yàn)操作，從而優(yōu)化了胰酪胨的理化性質(zhì)。

圖3 各項(xiàng)理化性質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品比較結(jié)果

2.4 微量元素檢測(cè)結(jié)果

為了確定制備出的胰酪胨符合微生物實(shí)驗(yàn)所需，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了實(shí)驗(yàn)測(cè)定了胰酪胨的微量元素項(xiàng)目，并且提供國(guó)外OXOID標(biāo)準(zhǔn)品的詳細(xì)參數(shù)，將制備的胰酪胨與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

表4 微量元素分析 μg/g

通過(guò)表4可以看出，實(shí)驗(yàn)制備出的胰酪胨各項(xiàng)微量元素水平除Ca以外，都和標(biāo)準(zhǔn)品相差不大，尤其是重金屬元素的水平還略低于標(biāo)準(zhǔn)品。Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高是因?yàn)楸镜貐^(qū)的水質(zhì)偏硬，所含Ca偏高。

2.4 氨基酸檢測(cè)結(jié)果

氨基酸是蛋白胨中的主要成分之一，也是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的重要營(yíng)養(yǎng)成分。對(duì)所制備的胰酪胨進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果如表5所示。由表5可以看出，該蛋白胨中的必需氨基酸種類齊全且質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，因此自制胰酪胨產(chǎn)品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表5 氨基酸組分分析 %

3 討 論

胰酪胨作為培養(yǎng)基關(guān)鍵原材料之一，其制備工藝以及制備出產(chǎn)品的質(zhì)量直接影響微生物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)胰酪胨的廠家參差不齊，生產(chǎn)出的胰酪胨產(chǎn)品質(zhì)量也無(wú)具體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)基是醫(yī)學(xué)衛(wèi)生研究、醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)、臨床細(xì)菌檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和生物制品制造等的重要基礎(chǔ)。胰酪胨作為培養(yǎng)基關(guān)鍵原材料，其質(zhì)量好壞直接決定了微生物檢驗(yàn)和生物產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)對(duì)胰酪胨制備工藝的研究較少，尤其是對(duì)制備出的胰酪胨無(wú)一套完整的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，各項(xiàng)理化性質(zhì)檢測(cè)手段也比較單一。

本研究中首先通過(guò)進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定了制備酪蛋白的最佳條件，即pH值為 4.7，溫度40℃時(shí)酪蛋白產(chǎn)量最高。再通過(guò)分別以水解度和氨基氮為指標(biāo)進(jìn)行的L9(34)正交試驗(yàn)確定胰蛋白酶水解酪蛋白制備胰酪胨的最佳水解參數(shù)，即pH 8.0，溫度55℃，時(shí)間2.5h，E/S為0.24，此時(shí)水解度達(dá)44.4%。按照此工藝條件制備出的胰酪胨通過(guò)各種檢測(cè)方法，將其各項(xiàng)理化指標(biāo)與國(guó)外同類型產(chǎn)品比較，差異不大，滿足胰酪胨產(chǎn)品的規(guī)格要求，符合微生物實(shí)驗(yàn)所需。進(jìn)行微量元素測(cè)定也證明實(shí)驗(yàn)制備出的胰酪胨各項(xiàng)微量元素水平與標(biāo)準(zhǔn)品接近，尤其是對(duì)微生物培養(yǎng)有害的重金屬元素含量極低。對(duì)所制得的胰酪胨進(jìn)行氨基酸分析，其氨基酸組成豐富，微生物生長(zhǎng)所需的谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其他必需氨基酸種類齊全且豐富可為微生物的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化出的胰酪胨制備工藝條件可為今后進(jìn)行大規(guī)模高質(zhì)量胰酪胨生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，有著良好的經(jīng)濟(jì)效益和較好的產(chǎn)業(yè)化前景。

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