趙靜， 錢鐳， 劉鵬

(1.黑龍江東方學院 食品與環(huán)境工程學部，哈爾濱 150086；2.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱 150028)

0 引 言

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，抗菌活性強，主要作用于革蘭氏陰性菌，常用于治療細菌感染，又因其廉價易得而得到廣泛的應用[1-4]中國農業(yè)部對動物性食品中慶大霉素殘留的檢測采用的是高效液相色譜法，以OPA為衍生劑進行柱后衍生[5]，但方法的重復性較差，靈敏度較低，檢測時間較長，由于OPA本身穩(wěn)定性較差[6-8]，衍生化試劑需臨時配制，且衍生產物也較易發(fā)生分解[9-11]。因此，為了方便乳及乳制品中抗生素殘留的日常監(jiān)測，需要建立能夠快速測定慶大霉素的簡單的檢測方法。

本研究采用相對穩(wěn)定的氯甲酸芴甲酯為衍生劑，進行柱前衍生，并對衍生條件進行了優(yōu)化，旨在建立一種能同時提取并凈化原料奶中慶大霉素的前處理方法，以期建立簡單，快速的慶大霉素殘留檢測技術。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

Waters2695高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、Empower色譜工作站，配Waters2475熒光檢測器；QL-901型振蕩器；Oasis MCX (mixed-modecation exchange)固相萃取柱；電子天平；離心機；氮吹儀；水浴鍋；酸度計等。

1.2 材料試劑

慶大霉素標物質(≥99%)：國家標準物質研究中心；乙腈(色譜純),天津科密歐公司；正己烷；庚烷磺酸鈉；氫氧化鉀；硼酸；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；氯化鈉；三氯乙酸；氯甲酸芴甲酯；甘氨酸；實驗用水均為三級水；

慶大霉素標準溶液：準確稱取慶大霉素標準品0.050mg,甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,搖勻，配成質量濃度為1.000 g/L標準貯備溶液，使用時按需要制成相應的標準工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30℃；檢測器為熒光檢測器；激發(fā)波長為350 nm、發(fā)射波長為450 nm；流動相：乙腈-水(75:25,V/V)；流速1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

1.3.2 樣品預處理

取慶大霉素標準溶液2 mL于指形瓶中，加入2 mL 0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液，加入0.4 mL氯甲酸芴甲酯衍生試劑，震蕩，暗處反應30 min，加入120 μL的甘氨酸溶液終止反應，待上機分析。

1.3.3 標準曲線的制備

將慶大霉素標準儲備液，依次稀釋為5，25，50，75，100，200，500 mg/L的標準工作液， 柱前衍生化處理后，取10 μL進樣，每個標準溶液重復進樣3次，以標準溶液濃度水平為橫坐標，以待測物色譜圖的平均峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 方法的專屬性

將空白輔料溶液、標準溶液、供試品溶液按樣品預處理方法項操作，分別進樣10 μL，獲得相應的色譜圖。

1.3.5 精密度和準確度的測定

分別在同一天和連續(xù)5 d測定質量濃度為25，100，500 mg/L的慶大霉素標準工作液，每個質量濃度設5個重復，根據(jù)日內與日間變異系數(shù)評價方法的精密度和準確度。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗

慶大霉素供試品溶液經(jīng)過樣品處理衍生后，每隔2 h進樣一次，每次進3針。

1.3.7 方法回收率實驗

空白輔料中加入質量濃度分別為25，100，500 mg/L的標準溶液，每一質量濃度進行 5個樣本分析，取10 μL進樣分析，獲得相應的峰面積。

1.3.8 靈敏度考察

向空白輔料中添加不同濃度的相應標準品溶液，以信噪比S/N=3時的最低質量濃度為最低檢測限，S/N=10時的最低質量濃度為最低定量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

C18和C8色譜柱均可用于慶大霉素的檢測[12]，本實驗采用C18柱。調整流動相乙腈與水的比例發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈比例的減少，慶大霉素出峰的時間會延長，出峰時間過早不利于慶大霉素殘留的充分檢出，可能會有雜質干擾，出峰時間過長，不利于快速檢測，綜合考慮，選擇乙腈與水的最優(yōu)比例為75:25，不僅可以排除雜質的干擾，同時可在較短的時間內將慶大霉素檢測出來。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

本研究中對不同的衍生條件進行了單因素優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)，緩沖溶液濃度為0.4 mol/L，pH值為12.0，衍生時間30 min時，可以到達最高的響應值。

2.3 標準曲線的繪制

將稀釋以后的慶大霉素溶液，分別上機測定，以得出的峰面積的平均值為縱坐標，上機所用慶大霉素溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線如圖1所示。

圖1 慶大霉素標準曲線

2.4 方法的專屬性

在上述色譜條件下，空白、加標樣品和標準品的色譜如圖2～圖4所示。由圖4可以看出，慶大霉素的保留時間是5.18 min，圖2和圖3說明空白樣品中的物質對慶大霉素的檢測沒有干擾。

圖2 空白奶樣色譜

圖3 空白奶樣加慶大霉素標準品色譜

圖4 慶大霉素標準工作液色譜

2.5 精確度和準確度實驗

分別選取了高、中、低三個濃度梯度的慶大霉素溶液，做日內和日間準確度和精密度實驗，結果如表1所示。由表1可以看出，該方法準確度良好，精確度符合實驗要求。

2.6 穩(wěn)定性實驗

慶大霉素供試溶液每隔2 h進樣一次，結果表明8 h內可獲得穩(wěn)定的測定結果，相對標準偏差為2.25%，穩(wěn)定性良好。

表1 慶大霉素在牛奶中的精密度和準確度

2.7 方法回收率實驗

向空白牛奶中加入標準慶大霉素溶液，使慶大霉素質量濃度為25，50，100 mg/L，并上機測定，得出方法回收率如表2所示。

表2 牛奶中慶大霉素的方法回收率

2.8 靈敏度實驗

根據(jù)信噪比(S/N)的值來確定最低定性檢測限和最低定量檢測限，結果表明該方法最低定性檢出限為0.15 mg/L，定量檢出限為0.35 mg/L。

3 討 論

本研究以乙腈與水為流動相，采用FMOC-Cl為衍生劑進行衍生，利用C18色譜柱進行分離檢測，可以較好地檢測出慶大霉素。該檢測方法中衍生條件溫和，可在室溫條件下操作，無需進行水浴加熱，降低了衍生溫度對實驗結果的影響，并且衍生物穩(wěn)定性較好，時間長達8 h，同時該方法靈敏度較高，最低定量檢測限為0.35 mg/L，定性檢測限為0.15 mg/L，所以該方法更適合乳中慶大霉素的檢測。

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