賈宏昉 張洪映 尹貴寧 黃化剛 徐國華 崔紅

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 國家煙草栽培生理生化基地，鄭州 450002；2.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，畢節(jié) 551700；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院，南京 210095）

磷是重要的植物營養(yǎng)元素，但是其在土壤中的有效性卻很低，因此土壤溶液中植物根系可吸收的有效磷濃度通常只有2-10 μmol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了植物的生長需要［1，2]。磷在土壤中的低有效性也誘導(dǎo)了植物在長期進(jìn)化過程中形成了一系列適應(yīng)低磷脅迫的機制［3]：（1）根系擴大生長，根毛數(shù)量增加；（2）增強碳代謝和一些磷酸酶及有機酸的分泌以活化土壤中的難溶性磷；（3）一系列與磷缺乏相關(guān)的基因誘導(dǎo)表達(dá)（主要為磷轉(zhuǎn)運蛋白）；其中，與磷酸鹽吸收直接相關(guān)的就是磷轉(zhuǎn)運蛋白，依據(jù)Km值的不同，磷轉(zhuǎn)運蛋白可以粗分為低親和力（Low Affinity）和高親和力（High Affinity）兩大運輸系統(tǒng)［4，5]。一般認(rèn)為，高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白（Pht1）家族是受磷營養(yǎng)缺乏而誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)，Km值在微摩爾的范圍內(nèi)，這與土壤中的有效磷濃度相當(dāng)［4，6]，因此Pht1在植物吸收磷酸鹽過程中起主要作用。

水稻中共有13個高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白家族成員［7]。OsPT8基因編碼的蛋白大小都約為58 kD，含有530個氨基酸殘基，由12個疏水的跨膜（TM）螺旋組成，每個跨膜螺旋包含有17-25個氨基酸殘基，在TM6和TM7有一個親水大環(huán)（Hydrophilic loop）將12個跨膜域分隔成兩組，即包括6個N端的跨膜區(qū)以及6個C端的跨膜區(qū)；蛋白的N端、C端及中間的親水大環(huán)都分布在細(xì)胞質(zhì)中，為典型的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［6，8]。前期的研究結(jié)果表明OsPT8雖然為組成型表達(dá)，但是仍受缺磷誘導(dǎo)表達(dá)增強，該基因在維持水稻體內(nèi)磷素的動態(tài)平衡過程中起關(guān)鍵作用。在水稻中過量表達(dá)OsPT8基因造成水稻植株在正常供磷條件下葉片積累大量的磷，植株矮小，表現(xiàn)出“磷中毒”現(xiàn)象［8]。到目前為止關(guān)于OsPT8基因在雙子葉植物上的功能還不清楚。因此，本試驗將水稻高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPT8轉(zhuǎn)入雙子葉模式植物煙草中，研究OsPT8基因?qū)煵萆L發(fā)育及耐低磷能力的影響，旨在從分子水平分析OsPT8基因在雙子葉植物中的功能，為培養(yǎng)磷高效作物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受體材料 煙草云煙87種子由本實驗室保藏。

1.1.2 基因、載體和菌株 水稻高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT8基因、植物表達(dá)載體Psla-4、農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 煙草轉(zhuǎn)化及分子檢測［9]構(gòu)建好的表達(dá)載體Ubi-Ps1a-4∷OsPT8通過電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。將鑒定為陽性的農(nóng)桿菌侵染無菌的煙草葉片，侵染過的葉片置于培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA）上進(jìn)行共培養(yǎng)，3 d后將其轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+100 mg/L Kan+500 mg/L Carb）中進(jìn)行培養(yǎng)，光照周期為16 h光照/8 h黑暗，2-3周后將抗性芽切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+100 mg/L Kan+500 mg/L Carb）中誘導(dǎo)生根，最終獲得轉(zhuǎn)基因煙草。PCR鑒定轉(zhuǎn)化苗，所用鑒定引物為水稻OsPT8基因特異引物，引物序列見表1。

表1 相關(guān)磷轉(zhuǎn)運蛋白基因RT-PCR和Q-PCR引物序列

1.2.2 轉(zhuǎn)基因材料的處理方法 沙培試驗于2012年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進(jìn)行，人工氣候室內(nèi)生長，基本條件：光強300 μmol/m2·s，光周期16 h；溫度25℃。煙草從種子消毒后在無菌水中黑暗催芽，露白后供給1/4營養(yǎng)液至四片真葉完全展開，然后進(jìn)行營養(yǎng)處理。營養(yǎng)液的配方及濃度為［9]：2 mmol/L KNO3，1 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L Ca（NO3）2，0.25 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgSO4，20 μmol/L Fe-EDTA，9 μmol/L MnCl2，46 μmol/L H3BO3，8 μmol/L ZnSO4，3 μmol/L CuSO4，0.03 μmol/L（NH4）2MoO4，pH調(diào)至5.5左右。設(shè)置兩個磷水平（1 mmol/L和0.1 mmol/L），以磷酸二氫鉀為磷源，缺磷處理的營養(yǎng)液中要用等量的KCl補足K+的含量。2 d換一次營養(yǎng)液，每天調(diào)節(jié)pH為6.0。處理時間為3周。

1.2.3 生物量統(tǒng)計 常規(guī)方法，10個重復(fù)。

1.2.4 全磷含量和有效磷含量測定［8，10]采用鉬藍(lán)比色法。

1.2.5 基因表達(dá)分析［8，9]采用Trizol法提取煙草總RNA，樣品通過隨機引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank發(fā)布的水稻高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因（Os-PT8）和煙草高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因（NtPT1和NtPT2）的序列設(shè)計各基因擴增引物，進(jìn)行RT-PCR和Q-PCR。按照Invitrogen公司的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒說明書進(jìn)行實時定量RT-PCR，每個樣品3次重復(fù)。實時定量的試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析，假設(shè)目的基因在脅迫處理下的表達(dá)量是對照（正常培養(yǎng)）的N倍，N=2-ΔΔCt，ΔΔCt=Treat（Ct樣品-CtL25）- CK（Ct樣品-CtL25）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Sigmplot10.0和SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 OsPT8轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及基因表達(dá)鑒定

將水稻中高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPT8插入到雙元表達(dá)載體Ubi-Ps1a-4，獲得Ubi -Ps1a-4∷OsPT8表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草中。用OsPT8基因中特異的片段序列設(shè)計引物對轉(zhuǎn)基因煙株陽性苗進(jìn)行檢測（數(shù)據(jù)未顯示），最后共得到OsPT8-Oe轉(zhuǎn)基因煙草陽性系株系15個，并獲得T0代種子。繼續(xù)對T1代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行檢測，最終選取其中兩個株系OsPT8-Oe1和OsPT8-Oe2（以下簡稱Oe1和Oe2）進(jìn)行后續(xù)的生理試驗。對所選取兩個轉(zhuǎn)基因株系的OsPT8基因進(jìn)行表達(dá)檢測，RT-PCR結(jié)果（圖1-A）顯示，OsPT8基因在兩個轉(zhuǎn)基因株系根部強烈表達(dá)，而野生型煙草中并未發(fā)現(xiàn)OsPT8基因的表達(dá)；為了確定檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時采用Real-Time PCR（Q-PCR）的方法檢測了轉(zhuǎn)基因株系和野生型根部的OsPT8基因表達(dá)水平，結(jié)果（圖1-B）顯示，野生型煙草根部幾乎檢測不到OsPT8基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因株系中OsPT8基因卻強烈表達(dá)，兩個轉(zhuǎn)基因株系中該基因的表達(dá)量差異不顯著，這與RT-PCR結(jié)果一致。表明OsPT8基因已經(jīng)整合到煙草基因組中并在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。

2.2 過量表達(dá)OsPT8對煙草幼苗生物量的影響

圖1 OsPT8過量表達(dá)株系的獲得及檢測

為了分析高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT8基因?qū)煵萆L發(fā)育的影響，對正常供磷（1 mmol/L Pi）和低磷（0.1 mmol/L Pi）處理3周的煙株進(jìn)行生物量統(tǒng)計。結(jié)果（圖2）顯示，在正常供磷條件下，兩個轉(zhuǎn)基因株系Oe1和Oe2的地下部生物量極顯著高于野生型，分別比野生型提高了39.13%和41.15%；地上部生物量相差不大，僅略高于野生型，差異不顯著（圖2-A）；兩個轉(zhuǎn)基因株系顯著增加了煙株的根冠比，分別比野生型提高了31.4%和32.6%（圖2-C），表明在正常供磷條件下過量表達(dá)OsPT8僅顯著增加了地下部的生物量，而對地上部生物量影響不顯著。低磷條件下轉(zhuǎn)基因煙株的地上部和地下部生物量均顯著高于野生型，達(dá)到了極顯著水平，其中兩個轉(zhuǎn)基因株系地下部和地上部與野生型相比分別提高了30.12%-31.55%和11.26%-12.11%（圖2-B）；由于兩個轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部生物量均顯著增加，因此轉(zhuǎn)基因株系根冠比略高于野生型（圖2-D）。這表明在低磷條件下過量表達(dá)OsPT8不僅顯著增加了轉(zhuǎn)基因煙草地下部的生物量，而對地上部的生物量也影響顯著。

2.3 過量表達(dá)OsPT8對煙草全磷和有效磷含量的影響

為了分析高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT8基因?qū)煵葜仓曛腥缀陀行Я追e累的影響，對正常供磷（1 mmol/L Pi）和低磷（0.1 mmol/L Pi）處理3周的煙株進(jìn)行取樣，測定不同部位的全磷和有效磷含量。對全磷含量的分析發(fā)現(xiàn)，在正常供磷條件下，轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部全磷含量均極顯著高于野生型，其中地上部達(dá)到了野生型的1.61和1.69倍，而地下部也均比野生型提高了40%左右，兩個轉(zhuǎn)基因株系地上部全磷含量增加量均顯著高于地下部（圖3-A）；在低磷條件下，轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部全磷含量均顯著高于野生型（圖3-B），地上部和地下部均比野生型提高50%左右，兩個轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部全磷含量增加量差異不顯著。對有效磷含量的分析發(fā)現(xiàn)，在正常供磷和低磷條件下，轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部有效磷含量也均顯著高于野生型（圖3-C，3-D），兩個轉(zhuǎn)基因株系有效磷含量達(dá)到了野生型的2倍左右。轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株全磷含量和有效磷含量分析結(jié)果基本一致，說明轉(zhuǎn)基因株系提高了煙株的有效磷利用，增強了煙草的耐低磷能力。

圖2 正常供磷（+P）和低磷（-P）條件下轉(zhuǎn)基因和野生型煙草生物量分析

2.4 過量表達(dá)OsPT8對煙草高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因（Pht1）表達(dá)的影響

植物在磷營養(yǎng)脅迫時，高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白會受缺磷誘導(dǎo)強烈表達(dá)，提高植物的磷吸收能力，以達(dá)到磷營養(yǎng)的最大程度優(yōu)化利用。目前，在煙草中共克隆出5個高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因（Pht1;1-Pht1;5，以下簡稱NtPT1-NtPT5），其中NtPT1和NtPT2受缺磷誘導(dǎo)表達(dá)量顯著增強；我們分析了轉(zhuǎn)基因株系和野生型煙草這兩個基因的表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）顯示，缺磷顯著上調(diào)了煙草高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白（NtPT1和NtPT2）基因的表達(dá)，尤其是在根部。我們同時檢測了兩個轉(zhuǎn)基因株系Oe1和Oe2在正常供磷和低磷條件下根部NtPT1和NtPT2基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在正常供磷條件下煙株過量表達(dá)OsPT8基因可誘導(dǎo)NtPT1和NtPT2基因的表達(dá)。分析NtPT1基因的表達(dá)（圖4-A）發(fā)現(xiàn)，正常供磷條件下Oe1和Oe2轉(zhuǎn)基因株系NtPT1表達(dá)量分別是野生型的1.82倍和3.26倍，而低磷條件下轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量雖然顯著高于野生型，但是該基因增加量卻遠(yuǎn)低于正常供磷的增加量。分析NtPT2基因的表達(dá)（圖4-B）發(fā)現(xiàn)，在正常供磷條件下未在野生型根系中檢測到該基因表達(dá)，而兩個轉(zhuǎn)基因株系中該基因強烈表達(dá)；在低磷條件下NtPT2基因表達(dá)量仍顯著高于野生型，均達(dá)到了野生型的2倍以上。基因表達(dá)分析表明，在煙草中過量表達(dá)OsPT8基因能改變煙草植株內(nèi)高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白家族成員的表達(dá)模式，可能與磷轉(zhuǎn)運蛋白家族成員之間的協(xié)同作用有關(guān)。

圖3 正常供磷（+P）和低磷（-P）條件下轉(zhuǎn)基因株系與野生型全磷和有效磷含量分析

圖4 正常供磷（+P）和低磷（-P）條件下轉(zhuǎn)基因株系和野生型根部高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)分析

3 討論

植物的生長離不開磷肥，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)肥料投入上畝施磷肥居高不下，植物對磷肥的吸收主要取決于植物根系，發(fā)掘植物中磷高效吸收的遺傳潛力是植物生物學(xué)家面臨的巨大任務(wù)［11]。鑒于此，本研究從水稻高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT8功能出發(fā)，探索該基因在雙子葉模式植物模式煙草中耐低磷能力，對于豐富植物磷營養(yǎng)高效的分子機制，解決生產(chǎn)中大量磷肥浪費等現(xiàn)實問題具有重要意義。本研究表明OsPT8轉(zhuǎn)基因煙草在低磷脅迫下地上部和根系生物量顯著高于野生型，全磷含量和有效磷含量均比野生型提高50%以上，OsPT8基因過量表達(dá)提高了煙草的耐低磷能力。

植物體內(nèi)磷缺乏時，蛋白質(zhì)的合成受到阻礙，形成新的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核較少，影響細(xì)胞正常分裂，導(dǎo)致生長比較緩慢，所以在形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出植株矮化，葉片變小，葉色暗綠或灰綠色，缺少光澤，分枝減少［12，13]。植物體內(nèi)可以直接利用的磷素為有效磷［14，15]，植物缺磷時，首先表現(xiàn)在植株各個部位有效磷含量顯著改變，本研究結(jié)果表明在煙草中過量表達(dá)OsPT8基因顯著提高了煙草有效磷的含量。在正常供磷條件下，煙株長勢良好，磷酸鹽利用率較高，這與水稻中的結(jié)果不盡一致。在水稻中該基因過量表達(dá)雖然增加了磷酸鹽的利用率，但是造成了“磷中毒”現(xiàn)象，影響了水稻植株的正常發(fā)育，而在煙草中并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，這可能是因為在水稻中OsPT8還參與磷信號與激素信號的互作，這還需要進(jìn)一步的研究來證實。

植物Pht1家族基因同源性很高，所以各成員之間在功能上可能存在相互協(xié)作［8，16]。OsPT8作為水稻中一個關(guān)鍵的磷轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)控水稻體內(nèi)磷素的動態(tài)平衡，影響水稻成熟期磷酸鹽從營養(yǎng)器官到生殖器官的轉(zhuǎn)運；在水稻中過量表達(dá)OsPT8基因同時可以引起其它Pht1家族成員的表達(dá)改變［8]。我們在煙草中的研究發(fā)現(xiàn)，在煙株中表達(dá)外源磷轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPT8增強了煙草自身高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白（NtPT1和NtPT2）基因的表達(dá)，這與在水稻中得到的基因協(xié)作結(jié)果相一致［8]，證明了磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白之間存在協(xié)作。

4 結(jié)論

本試驗在煙草中驗證了OsPT8基因的功能，證明了該基因?qū)τ谔岣咦魑锏牧姿猁}利用率具有重要作用，在煙草中過量表達(dá)該基因提高了煙草的耐低磷能力，為植物基因工程培養(yǎng)磷高效作物提供了理論依據(jù)。

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