王 璐，段冉冉，趙 盼，周曉華，2

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，廣東 廣州510642;2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物材料研究所，廣東 廣州510642)

設(shè)計(jì)配合物分子的形狀、對(duì)稱性以及官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，使其與DNA 分子匹配，從而對(duì)DNA 進(jìn)行特異性識(shí)別，這一系列的研究工作是尋找新型DNA 結(jié)構(gòu)探針、DNA 斷裂劑、化學(xué)核酸酶和殺菌劑的研究基礎(chǔ)，已引起科學(xué)界的廣泛重視［1-3］.研究表明，DNA 特異性結(jié)合劑Lexitropsin 分子中都含有咪唑、吡咯和噻唑氨羰基基團(tuán)［4］.2-取代苯并咪唑是苯并咪唑的重要衍生物，其化學(xué)和生物活性往往高于其他位置取代的衍生物.其中，2-氨甲基苯并咪唑(AMB)在結(jié)構(gòu)上非常類似咪唑、嘌呤堿和嘧啶堿等生物配體，能與生物酶和受體等形成氫鍵、發(fā)生疏水作用和π-π相互作用，且具有良好的抗寄生物、抗癌和抗菌等活性［5-8］.目前含AMB 配體的配合物雖已有一些報(bào)道［7-11］，但大多只研究了晶體結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和光學(xué)性質(zhì)，AMB 與DNA 的特異性識(shí)別研究報(bào)道很少［8-9］.因此研究AMB-過渡金屬(Ⅱ)配合物不僅有助于了解其結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系，而且為設(shè)計(jì)DNA 的特異性識(shí)別劑和斷裂劑奠定理論依據(jù).本文以AMB作主配體，以鄰菲咯啉(phen)為輔配體，合成了2 個(gè)配合物:［Cu(AMB)2Cl］Cl·4H2O(配合物1)和［Cu(AMB)(phen)Cl］Cl·2H2O(配合物2).通過元素分析、IR、UV 和摩爾電導(dǎo)率等方法對(duì)配合物進(jìn)行了組成和結(jié)構(gòu)表征.用二倍稀釋法測(cè)試了2 個(gè)配合物的最小抑菌濃度(MIC)，用紫外光譜(UV-Vis)、熒光光譜、相對(duì)黏度及瓊脂糖凝膠電泳法初步研究了配合物與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用.

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

上海宇隆儀器有限公司DDS-12A 型電導(dǎo)率儀;美國(guó)Nicolet 360 FT-IR 型紅外光譜儀(KBr 壓片);德國(guó)Elementar Vario EL Cube 元素分析儀;日本島津UV-2550 型紫外/可見分光光度計(jì);日本島津RF-5301PC 熒光光譜儀;上海晶菱玻璃有限公司烏氏黏度劑;大連捷邁科貿(mào)有限公司凝膠電泳池;意大利米蘭BIO-RAD Laboratories-Segrate 公司BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng).

AMB·2HCl 參照文獻(xiàn)［12］合成.ct-DNA、Tris、溴化乙啶(EB)、瓊脂糖凝膠和pBR322 DNA 為生化試劑，其他試劑為分析純.

1．2 配合物的合成

配合物1:稱取1 mmol AMB·2HCl 溶于10 mL蒸餾水中，并用NaOH 調(diào)pH7～8，加入0.5 mol·L-1CuCl2溶液1.0 mL，反應(yīng)10 min，并調(diào)pH 4.8，50 ℃條件下加熱攪拌15 min，冷卻至室溫，過濾，室溫靜置1 d 后析出藍(lán)色固體1，過濾并依次用少量水和乙醇洗滌后干燥.

配合物2:合成方法與配合物1 相似.按照n(Cu)∶n(AMB)∶n(phen)=1∶1∶1 投料，在合成配合物1 的反應(yīng)液中加入5 mL phen 乙醇溶液.反應(yīng)液在室溫放置1周后析出藍(lán)色晶體2，過濾，洗滌，干燥.

1．3 配合物的抑菌活性

通過二倍溶液稀釋法測(cè)定了配合物1 和配合物2 的最小抑菌濃度(MIC).受試菌種為2 種革蘭陰性菌(大腸埃希菌Escherichia coil 和沙門桿菌Salmonella typhi)和2 種革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis).

1．4 配合物與ct-DNA 的相互作用

配合物與ct-DNA 相互作用研究均在pH 7.2 的Tris-HCl/NaCl 緩沖液中進(jìn)行.緩沖液含5 mmol·L-1Tris 和50 mmol·L-1NaCl.瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)中，每升TBE 電泳緩沖液(pH 8.3)含0.045 mol Tris、0.45 mol H3BO3和1 mol EDTA.ct-DNA 的濃度參照文獻(xiàn)［13］確定.

1.4.1 紫外光譜 將0.062 5 mmol·L-1配合物溶液3 mL 和Tris-HCl / NaCl 緩沖溶液3 mL 分別加入樣品比色皿和空白比色皿中，再分別加入等體積的ct-DNA 溶液，每次充分搖勻靜置15 min 后，在200～400 nm 掃描配合物的紫外光譜.

1.4.2 熒光光譜 當(dāng)含5.5 μmol·L-1ct-DNA 和4.8 μmol·L-1EB 混合溶液的熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定后，逐步增加配合物的濃度，在λex=525 nm 和υscan=240 nm·s-1下，在550～650 nm 測(cè)定混合溶液的熒光強(qiáng)度.

1.4.3 黏度 在c(ct-DNA)=0.2 mmol·L-1下，依次增大配合物濃度，在(29.0 ±0.1)℃下，測(cè)定DNA-配合物緩沖溶液流過毛細(xì)管所需時(shí)間(t)，計(jì)算比黏度(η):

其中，t0為緩沖溶液流過毛細(xì)管所需時(shí)間.

ct-DNA 溶液的比黏度以η0表示.以c(配合物)/c(ct-DNA)為橫坐標(biāo)，以(η/η0)1/3為縱坐標(biāo)作圖，分析配合物與DNA 的結(jié)合方式.

1.4.4 配合物對(duì)pBR322 DNA 的切割作用 將配合物、VC(濃度是配合物的30～70 倍)與pBR322 DNA(200 ng)混合，用Tris-HCl / NaCl 緩沖液定容至20 μL，在37 ℃恒溫條件下靜置1 h 后，加入3 μL Loading buffer，在8 g·L-1瓊脂糖凝膠和TBE 電泳液中，用100 V 電壓電泳40 min.用Gold View(4～5 μL)作著色劑，以溴酚藍(lán)為指示劑，在紫外檢測(cè)儀下觀察并拍照.在上述混合體系中分別加入活性氧抑制劑{·OH抑制劑［二甲基亞砜(DMSO)，4μL］、1O2抑制劑［2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TMP)、NaN3，100 μmol·L-1］}，通過電泳帶的變化探索配合物對(duì)質(zhì)粒DNA 的切割機(jī)理.

2 結(jié)果與分析

2．1 配合物的組成和結(jié)構(gòu)

配合物1 和配合物2 的化學(xué)式、化學(xué)元素分析數(shù)據(jù)和摩爾電導(dǎo)率(Λm)列于表1.

表1 配合物的元素組成分析Tab．1 The elemental analysis of the complex

在室溫條件下的甲醇溶液中，配合物1 和配合物2 的摩爾電導(dǎo)率數(shù)據(jù)表明2 個(gè)配合物在甲醇中是1∶1 型電解質(zhì)［14］.即Cu2+與配體形成的配陽(yáng)離子與抗衡離子Cl-在甲醇中按1∶1 解離.

配體和配合物的IR 和UV-Vis 光譜數(shù)據(jù)及其分析指認(rèn)歸納于表2 中.從表2 可以看出，配體AMB的νN-H在配合物1 和配合物2 中都向低波數(shù)方向發(fā)生了移動(dòng)，結(jié)合苯并咪唑的νC=C，νC=N和γC-H的峰位變化，說明AMB 的—NH2氮和苯并咪唑環(huán)的氮都參與了配位，這與文獻(xiàn)［7-9］的報(bào)道一致.在配合物2中，雖然νN-H和νO-H重疊在一起，但在1 600 cm-1左右的2 個(gè)νC=C，νC=N的峰位相對(duì)于配合物1 發(fā)生了位移，而且在指紋區(qū)出現(xiàn)了3 個(gè)中強(qiáng)度的吸收峰，其峰位均低于配體，但又不同于配合物1.由此說明:在配合物2 中phen 和AMB 都與Cu2+發(fā)生了配位作用［15］.

表2 配合物與配體的IR 和UV-Vis 吸收峰歸屬Tab．2 The attribution of the IR ＆ UV-Vis absorption peaks of the complex and the ligand

在UV-Vis 光譜中，配合物1 和配合物2 的甲醇溶液在紫外光區(qū)和可見光區(qū)出現(xiàn)的吸收峰與文獻(xiàn)［8］相近，說明配合物1 和配合物2 也為四方錐構(gòu)型［7-8］.

綜合上述IR、摩爾電導(dǎo)率、UV-Vis 和元素分析結(jié)果，配合物1 和配合物2 的分子式分別為:［Cu(AMB)2Cl］Cl·4H2O 和［Cu(AMB)(phen)Cl］Cl·2H2O，推測(cè)2 個(gè)配合物的配位構(gòu)型如圖1 所示.

2．2 配合物的抑菌活性

圖1 推測(cè)的配合物1 和配合物2 的分子配位構(gòu)型Fig.1 Speculated molecular structures of the complex 1 and 2

表3 配合物的抑菌活性Tab．3 The bacteriostatic activity of the complex for the assayed bacteria

配合物1、配合物2 和對(duì)照物的最小抑菌濃度見表3.從表3 可以看出:對(duì)4 種受試菌種，配合物1 和配合物2 的抑菌活性明顯高于CuCl2和AMB，說明AMB配位后與Cu(II)產(chǎn)生協(xié)同作用，提高了抑菌活性;配合物2 的抑菌活性雖然比配合物1 高，但是與phen 相近.這可能是phen 配體取代了配合物1 的AMB 后，配合物2 的脂溶性提高且接近于phen 的緣故.這一推測(cè)從配合物2 在無水乙醇中的溶解性高于甲醇可以佐證.

2．3 配合物與DNA 的相互作用

2.3.1 紫外光譜 UV 光譜的變化可以反映出配合物與DNA 結(jié)合后配體的電子結(jié)構(gòu)受DNA 擾動(dòng)的情況.當(dāng)配合物插入DNA 堿基對(duì)或與DNA 雙螺旋溝槽中的堿基發(fā)生非共價(jià)結(jié)合時(shí)，可使π電子躍遷幾率減小，會(huì)產(chǎn)生減色效應(yīng);另外，如果配離子帶正電，其易靠近DNA 槽內(nèi)帶負(fù)電的磷酸基，使得磷酸生色團(tuán)內(nèi)陷，也會(huì)降低小分子-DNA 復(fù)合體系的紫外吸收.一般地，紫外吸收減色、吸收帶紅移和等色點(diǎn)的出現(xiàn)是小分子與DNA 發(fā)生嵌插作用的光譜標(biāo)志［16］.配合物1 和配合物2 與ct-DNA 作用的紫外光譜如圖2 所示.從圖2 可見，隨著c(ct-DNA)的增加，配合物1 的紫外光譜只發(fā)生了輕微的減色效應(yīng)，而配合物2 發(fā)生了明顯的減色并在300 nm 附近出現(xiàn)了等色點(diǎn).當(dāng)c(ct-DNA)/c(配合物)=2.1 時(shí)，在270 nm 處配合物1 的減色率僅為1.48%，而配合物2 的減色率為18.0%.與DNA 插入劑［Ru(bpy)2L］2+(其中，L=phen、IP 或PIP)的減色率12%～22%［17］比較，推測(cè)配合物1 以非插入方式與DNA 結(jié)合，而配合物2 以插入方式結(jié)合DNA.

2.3.2 熒光光譜 EB 分子中含有三環(huán)剛性平面，是弱熒光物質(zhì)［1］，它可以嵌入DNA 堿基對(duì)之間而使熒光顯著增強(qiáng).因此以EB 作為DNA 結(jié)構(gòu)探針，可以研究金屬配合物與DNA 的作用方式.當(dāng)其他分子與DNA 作用，將EB 從DNA 的堿基對(duì)中擠出來時(shí)，DNA/EB 體系的熒光發(fā)生猝滅.配合物1 和配合物2與ct-DNA 作用的熒光光譜見圖3.從圖3 可以看出，隨著c(配合物)的增加，EB-DNA 體系的熒光強(qiáng)度明顯下降，說明配合物與EB-DNA 結(jié)合后使EB 從復(fù)合體系中逸出.

圖3 配合物對(duì)EB-DNA 體系熒光光譜的影響Fig.3 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EB-DNA system

［17］所述方法，按照Stern-Volmer 方程I0/I=1 +Ksqr(I 和I0分別為滴加和未滴加配合物時(shí)EB-DNA 體系的熒光強(qiáng)度;r 為配合物與DNA 的濃度比;Ksq為猝滅常數(shù))，以I0/I 對(duì)r 作圖，獲得的直線(圖3 中小圖)斜率就是Ksq.Ksq越大，說明配合物對(duì)EB-DNA 體系的猝滅程度越大，與DNA 的作用越強(qiáng).試驗(yàn)測(cè)得配合物1 和配合物2 對(duì)EB-DNA 熒光體系的猝滅常數(shù)Ksq分別為0.059 2 和0.135 0，表明2 個(gè)配合物均能與ct-DNA 結(jié)合，結(jié)合強(qiáng)弱順序?yàn)榕浜衔?＜配合物2.這可能是由于配合物2 中配體phen 的剛性環(huán)面積大于AMB，疏水作用較強(qiáng)，容易嵌入DNA 堿基對(duì)間的緣故.

2.3.3 黏度 黏度法是檢測(cè)在溶液中配合物與DNA 結(jié)合模式的一種有效方法.一般地，如果配合物與DNA 以靜電、溝槽結(jié)合等非插入方式結(jié)合，DNA雙鏈?zhǔn)艿降挠绊懞苄?，則DNA 溶液黏度變化不明顯;如果配合物部分插入DNA 堿基對(duì)之間，DNA 的雙鏈會(huì)發(fā)生扭結(jié)縮短，則溶液的黏度減小;而如果配合物完全嵌入DNA 堿基對(duì)間，DNA 的雙鏈會(huì)被拉伸變長(zhǎng)，則DNA 溶液的黏度增加［18-19］.隨著配合物的加入，ct-DNA 溶液的比黏度變化見圖4.從圖4 可以看出，隨著配合物濃度的增大，配合物1-DNA 復(fù)合體系的相對(duì)比黏度變化不大，而配合物2-DNA 復(fù)合體系的相對(duì)比黏度增幅明顯.這表明2 個(gè)配合物與ct-DNA的結(jié)合方式不同:配合物1 以靜電或溝槽方式結(jié)合，而配合物2 是以插入方式結(jié)合.這與前面UV 和熒光光譜的結(jié)果吻合.

圖4 DNA 的相對(duì)比黏度隨配合物加入量的變化Fig.4 Effects of increasing amounts of complexes on the relative viscosity of DNA

2.3.4 配合物對(duì)pBR322 DNA 的斷裂作用 通常pBR322 DNA 有3 種構(gòu)型:Ⅰ型—超螺旋型(完整的pBR322 DNA);Ⅱ型—環(huán)形(1 條鏈上有一個(gè)切口);Ⅲ型—線型(在同一位置2 條鏈斷裂).在電泳時(shí)，3種構(gòu)型的遷移速率存在明顯差別，遷移速率大小順序?yàn)?Ⅰ型＞III 型＞Ⅱ型.在恒溫37 ℃條件下，配合物1 和配合物2 切割質(zhì)粒DNA 的瓊脂糖凝膠電泳效果見圖5.從圖5 可見，雖然在還原劑VC存在下，CuCl2、AMB 和phen 對(duì)pBR322 DNA 均未顯示出切割作用，但2 個(gè)配合物卻均能將Ⅰ型pBR322 DNA切割成Ⅱ型，切割能力為配合物2＞配合物1.

圖5 配合物1 和配合物2 及配體切割pBR322 DNA 的凝膠電泳圖(37 ℃)Fig.5 Agarose gel eletrophoresis for the cleavage of pBR322 DNA by the complex1，2 and the ligand at 37 ℃

因Cu2+具有氧化還原性，因此Cu 配合物切割DNA 大多涉及氧化機(jī)理［20］.為進(jìn)一步驗(yàn)證配合物是通過氧化機(jī)理切割DNA，在活性氧清除劑DMSO、TMP 或NaN3存在下，測(cè)試了配合物1 和配合物2 對(duì)pBR322 DNA 的切割作用(圖6).

圖6 活性氧清除劑存在下配合物1 和配合物2 切割pBR322 DNA 的凝膠電泳圖Fig.6 Cleavage of pBR322 DNA by the complex 1 and 2 in the presence of active oxygen scavenging agent

切割機(jī)理試驗(yàn)說明，在還原劑VC存在下，配合物1 和配合物2 均能將Ⅰ型pBR322 DNA 切割成Ⅱ型，而在加入·OH 抑制劑DMSO 后，配合物1 和配合物2 對(duì)pBR322 DNA 的切割作用明顯被抑制(圖6泳道3);加入1O2抑制劑TMP 或NaN3后，切割作用基本沒有變化，由此推測(cè)2 個(gè)配合物可能通過羥基自由基氧化機(jī)理切割pBR322 DNA.這與文獻(xiàn)［8，18-19］結(jié)果一致.

3 結(jié)論

本文合成了Cu(Ⅱ)-AMB 二元配合物和AMBCu(Ⅱ)-phen 三元配合物，通過元素分析、IR、UV-Vis和摩爾電導(dǎo)率對(duì)2 個(gè)配合物進(jìn)行了組成和結(jié)構(gòu)表征，推測(cè)2 個(gè)配合物的分子式分別為:［Cu(AMB)2Cl］Cl·4H2O(配合物1)和［Cu(AMB)(phen)Cl］Cl·2H2O(配合物2).

光譜法和黏度法的研究結(jié)果表明:配合物1 和配合物2 分別以非插入方式和插入方式與ct-DNA結(jié)合，結(jié)合能力為配合物2＞配合物1.

瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)說明，在VC作用下2 個(gè)配合物都可通過·OH 機(jī)理斷裂pBR322 DNA.

配合物1 和配合物2 對(duì)大腸埃希菌、沙門桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制作用高于AMB，配合物2 的MIC 與phen 相近，抑菌活性表現(xiàn)為配合物2＞配合物1.2 個(gè)配合物的抑菌活性強(qiáng)弱次序與結(jié)合DNA 的強(qiáng)弱次序剛好一致，二者是否存在關(guān)聯(lián)還需深入研究.

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