劉麗等

摘要：以蛭弧菌、光合細菌、乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌、水產(chǎn)生物腸道有益菌作為1種微生物制劑，以潑灑的方式應(yīng)用于羅非魚養(yǎng)殖水體中，探究其對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖生物腸道菌群結(jié)構(gòu)、羅非魚生長的影響。結(jié)果表明：與對照相比，革蘭氏陰性、陽性菌群以及本土革蘭氏陰性、陽性菌群數(shù)量均明顯減少；與對照相比，試驗組保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、光合細菌、有益菌數(shù)量均增加，本土微生物留下的生態(tài)灶由有益菌填補，維持了菌群平衡。該微生物制劑具有改善水體和生物腸道菌群結(jié)構(gòu)以及促進養(yǎng)殖動物生長的作用。

關(guān)鍵詞：有益菌；蛭弧菌；羅非魚；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S965.125 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0175-03

收稿日期：2013-08-01

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：40776091）。

作者簡介：劉麗（1988—），女，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事海洋微生物研究。E-mail：liuliliuwei@gmail.com。

通信作者：蔡俊鵬，博士，教授，主要從事海洋微生物研究。Tel：（020）87113024；E-mail：febjpcai@scut.edu.cn。目前，人類對動物性蛋白質(zhì)的需求量急劇增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物逐漸成為重要的動物蛋白來源[1]。為了預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病并促進養(yǎng)殖動物生長，濫用抗菌藥物、殺蟲劑、消毒劑的現(xiàn)象越來越普遍[2]。為了促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，益生菌在水生動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越多[3-4]。益生菌是一種對人體及動物有益的微生物膳食補充劑，能提高飼料的營養(yǎng)價值、抑制病原微生物生長、促進動物生長、增強動物免疫力[5]。Iebba等首次證實蛭弧菌是存在于人體中的一種有益微生物[6]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，與抗生素滅菌方法相比，利用蛭弧菌消除或者抑制致病菌更具有優(yōu)越性[7]。乳酸菌、保加利亞乳桿菌也是常見的被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌[8]。光合細菌含有生物輔助因子，能提高魚幼苗的存活率并促進魚的生長[9]。本研究提供了1種能改善水體、生物腸道菌落結(jié)構(gòu)菌劑的制備方法，并探討其在羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用。該菌劑包括蛭弧菌（Bdellovibrio）菌液與有益菌菌液，其中有益菌菌液由光合細菌、乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、水產(chǎn)生物腸道有益菌混合而成，水產(chǎn)生物腸道有益菌3y621是筆者所在實驗室從羅非魚腸道中分離出的蛋白酶高產(chǎn)菌株[10]。

1材料與方法

1.1材料

蛭弧菌BDF01由筆者所在實驗室從海水中分離純化而來。紅假單胞菌（Rhodopseudomonas sp.）菌株編號1.2193，購于中國科學(xué)院微生物研究所。乳酸鏈球菌菌株編號 GIM1156、保加利亞乳桿菌菌株編號GIM1.8、嗜水氣單胞菌菌株編號GIM1.172均購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。水產(chǎn)生物腸道有益菌3y621是筆者所在實驗室從羅非魚腸道中分離出的蛋白酶高產(chǎn)菌株。試驗地點：廣東省湛江市某羅非魚養(yǎng)殖場。

1.2培養(yǎng)基

優(yōu)化的RCVBN培養(yǎng)基：3.0 g CH3COONa、1.0 g （NH4）2SO4、0.2 g MgSO4、1.0 g NaCl、0.3 g KH2PO4、0.5 g K2HPO4、0.05 g CaCl2、0.1 g酵母膏、1 mL微量元素溶液、1 000 mL 蒸餾水。微量元素溶液組成為：2 g EDTA-2Na、0.2 g FeSO4·7H2O、0.1 g MnSO4·4H2O、0.1 g H3BO3、0.1 g CoCl2·6H2O、0.1 g ZnCl2、0.02 g Na2MoO4·2H2O、0.02 mg NiCl2·6H2O、0.01 g CuCl2·2H2O、1 000 mL蒸餾水，pH值7.0～7.2。DNB液體培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯0.8 g、酪蛋白酸水解物0.5 g、酵母提取物0.1 g、NaCl 30 g、1 000 mL蒸餾水，pH值7.2～7.6。LB液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）、伊紅美藍瓊脂（EMB）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯、疊氮血瓊脂（Azide Blood）均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1蛭弧菌菌液的制備采用高密度蛭弧菌游泳體發(fā)酵方法制備蛭弧菌菌液。制備的培養(yǎng)液于6 000 r/min 4 ℃離心20 min后取上清，再將上清液于16 000 r/min 4 ℃離心 20 min 后棄上清，加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌濃度為1×105 PFU/mL。

1.3.2有益菌菌液的制備將紅假單胞菌按1 g/L接種到優(yōu)化的RCVBN液體培養(yǎng)基中，于30 ℃ 3 000 lx下光照厭氧培養(yǎng)48 h后得到的菌液按體積比10%接種到優(yōu)化的RCVBN液體培養(yǎng)基中，以同樣的條件光照厭氧培養(yǎng) 48 h，適當(dāng)攪拌，5 000 r/min離心15 min得到菌體，往沉淀中加入無菌生理鹽水，調(diào)節(jié)其終濃度為1×105 CFU/mL。分別挑取菌株3y621、乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌單菌落接種到NB液體培養(yǎng)基中，30 ℃120 r/min培養(yǎng)過夜后按體積比1%接種到NB液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃120 r/min發(fā)酵12～48 h后5 000 r/min離心15 min獲得菌體，往沉淀中加入無菌生理鹽水，調(diào)節(jié)菌液濃度為1×105 CFU/mL。將以上各有益菌等比混合，得到益菌劑。將蛭弧菌濃縮液與有益菌按體積比 1 ∶2 混合，用磁力攪拌器攪拌均勻，得到菌劑。

1.3.3羅非魚養(yǎng)殖試驗將6個羅非魚養(yǎng)殖池（0.5 m×0.5 m×0.5 m）分為試驗組、對照組，每組3個，在每個池中注入100 L淡水，投放30尾羅非魚（平均體長2.36 cm，均重 0.58 g），水溫25 ℃，在試驗組各池中均勻潑灑按“1.3.2”的方法制得的菌劑，每2周潑灑1次。檢測養(yǎng)殖水體與羅非魚腸道的革蘭氏陰性菌群、陽性菌群、有益菌的濃度，試驗組與對照組每10 d隨機抽取50尾羅非魚測量其體重與體長。水池中菌群濃度檢測方法為：施用有益菌后立即檢測水體中菌群濃度，第1次記為0 d，往后每14 d檢測1次，共檢測5次，采用涂布選擇培養(yǎng)基平板法。羅非魚腸道微生物菌群濃度檢測方法為：施用菌劑后第60天，取羅非魚腸道中食糜 0.2 g 置于無菌離心管中，加入1.8 mL 0.85%無菌生理鹽水，制成原液，然后依次10倍稀釋涂布選擇培養(yǎng)基平板，使用MPN法進行檢測。采用伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基檢測革蘭氏陰性菌數(shù)量，采用甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基檢測革蘭氏陰性菌數(shù)量，采用RCVBN瓊脂培養(yǎng)基檢測光合菌數(shù)量，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基檢測保加利亞乳桿菌數(shù)量，采用疊氮血瓊脂培養(yǎng)基檢測乳鏈球菌數(shù)量。采用特異性熒光定量PCR方法檢測有益菌3y621數(shù)量，上、下游引物分別為：5′-AGGATGAAGAAGTCCTGT-3′和5′-TGATTTAATTGCTCGTATATTTACCCAGT-3′，反應(yīng)程序采用三步法。養(yǎng)殖水體與腸道中土生菌群數(shù)量的計算方法如下：本土革蘭氏陰性菌群數(shù)量=EMB瓊脂檢測到的細菌數(shù)量；本土革蘭氏陽性菌群數(shù)量=甘露醇氯化鈉瓊脂檢測到的細菌數(shù)量-保加利亞乳桿菌數(shù)量-乳鏈球菌數(shù)量-有益菌3y621的數(shù)量。endprint

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌劑對羅非魚養(yǎng)殖水體微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

3結(jié)論與討論

自益生菌首次在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用以來，已經(jīng)被證實其具有控制養(yǎng)殖水體中病原體、提高水生動物存活率的作用，但很少有關(guān)于益生菌調(diào)節(jié)水生動物腸道菌群的研究[11-16]。本研究首次將有益菌應(yīng)用于羅非魚的養(yǎng)殖水體，從而達到同時控制養(yǎng)殖水體、生物腸道內(nèi)潛在致病菌的目的。本研究使用的有益菌劑由蛭弧菌菌液及有益菌菌液組成，蛭弧菌消除致病菌后留下的生態(tài)灶由有益菌來填補。本研究表明，與對照相比，革蘭氏陰性、陽性菌群以及本土革蘭氏陰性、陽性菌群數(shù)量均減少；與對照相比，試驗組保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、光合細菌、有益菌數(shù)量均增加，本土微生物留下的生態(tài)灶由有益菌填補，維持了菌群平衡。蛭弧菌具有裂解致病菌的特殊功效，可以用作生物凈化因子[17]。蔡俊鵬等認為，蛭弧菌作為生物消除劑對弧菌有裂解消除能力[18]。因此，利用蛭弧菌去除養(yǎng)殖環(huán)境及腸道中的病原體逐漸成為一種相對于施用抗生素而言更好、更有效的辦法[19-20]。本研究所使用的有益菌液由光合細菌、保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、腸道有益菌3y621混合而成，每種有益菌在調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體與腸道微生態(tài)平衡方面各自發(fā)揮著獨特的功效。其中，光合細菌產(chǎn)生的抗病毒物質(zhì)與乳酸鏈球菌產(chǎn)生的嗜酸菌素對病原微生物有抑制作用[21]。保加利亞乳桿菌以某種免疫調(diào)節(jié)因子刺激腸道局部型免疫反應(yīng)，以提高機體抗體水平，增強其免疫力。有學(xué)者認為，分離自動物腸道的特有的益生菌更易定植于養(yǎng)殖動物的腸道，這可能是因為它們更容易適應(yīng)腸道內(nèi)特殊的環(huán)境。研究顯示，高濃度的某些益生菌對養(yǎng)殖動物會產(chǎn)生毒害作用[22]，今后有必要進一步探討不同濃度益生菌對養(yǎng)殖動物生長的影響。此外，益生菌不同施用方式是否也會影響益生菌的功效，應(yīng)進一步深入研究。

參考文獻：

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[22]Nayak S K. Probiotics and immunity：a fish perspective[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010，29（1）：2-14.endprint

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌劑對羅非魚養(yǎng)殖水體微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

3結(jié)論與討論

自益生菌首次在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用以來，已經(jīng)被證實其具有控制養(yǎng)殖水體中病原體、提高水生動物存活率的作用，但很少有關(guān)于益生菌調(diào)節(jié)水生動物腸道菌群的研究[11-16]。本研究首次將有益菌應(yīng)用于羅非魚的養(yǎng)殖水體，從而達到同時控制養(yǎng)殖水體、生物腸道內(nèi)潛在致病菌的目的。本研究使用的有益菌劑由蛭弧菌菌液及有益菌菌液組成，蛭弧菌消除致病菌后留下的生態(tài)灶由有益菌來填補。本研究表明，與對照相比，革蘭氏陰性、陽性菌群以及本土革蘭氏陰性、陽性菌群數(shù)量均減少；與對照相比，試驗組保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、光合細菌、有益菌數(shù)量均增加，本土微生物留下的生態(tài)灶由有益菌填補，維持了菌群平衡。蛭弧菌具有裂解致病菌的特殊功效，可以用作生物凈化因子[17]。蔡俊鵬等認為，蛭弧菌作為生物消除劑對弧菌有裂解消除能力[18]。因此，利用蛭弧菌去除養(yǎng)殖環(huán)境及腸道中的病原體逐漸成為一種相對于施用抗生素而言更好、更有效的辦法[19-20]。本研究所使用的有益菌液由光合細菌、保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、腸道有益菌3y621混合而成，每種有益菌在調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體與腸道微生態(tài)平衡方面各自發(fā)揮著獨特的功效。其中，光合細菌產(chǎn)生的抗病毒物質(zhì)與乳酸鏈球菌產(chǎn)生的嗜酸菌素對病原微生物有抑制作用[21]。保加利亞乳桿菌以某種免疫調(diào)節(jié)因子刺激腸道局部型免疫反應(yīng)，以提高機體抗體水平，增強其免疫力。有學(xué)者認為，分離自動物腸道的特有的益生菌更易定植于養(yǎng)殖動物的腸道，這可能是因為它們更容易適應(yīng)腸道內(nèi)特殊的環(huán)境。研究顯示，高濃度的某些益生菌對養(yǎng)殖動物會產(chǎn)生毒害作用[22]，今后有必要進一步探討不同濃度益生菌對養(yǎng)殖動物生長的影響。此外，益生菌不同施用方式是否也會影響益生菌的功效，應(yīng)進一步深入研究。

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[20]Hargreaves J A. Photosynthetic suspended-growth systems in aquaculture[J]. Aquacultural Engineering，2006，34（3）：344-363.

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1.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌劑對羅非魚養(yǎng)殖水體微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

3結(jié)論與討論

自益生菌首次在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用以來，已經(jīng)被證實其具有控制養(yǎng)殖水體中病原體、提高水生動物存活率的作用，但很少有關(guān)于益生菌調(diào)節(jié)水生動物腸道菌群的研究[11-16]。本研究首次將有益菌應(yīng)用于羅非魚的養(yǎng)殖水體，從而達到同時控制養(yǎng)殖水體、生物腸道內(nèi)潛在致病菌的目的。本研究使用的有益菌劑由蛭弧菌菌液及有益菌菌液組成，蛭弧菌消除致病菌后留下的生態(tài)灶由有益菌來填補。本研究表明，與對照相比，革蘭氏陰性、陽性菌群以及本土革蘭氏陰性、陽性菌群數(shù)量均減少；與對照相比，試驗組保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、光合細菌、有益菌數(shù)量均增加，本土微生物留下的生態(tài)灶由有益菌填補，維持了菌群平衡。蛭弧菌具有裂解致病菌的特殊功效，可以用作生物凈化因子[17]。蔡俊鵬等認為，蛭弧菌作為生物消除劑對弧菌有裂解消除能力[18]。因此，利用蛭弧菌去除養(yǎng)殖環(huán)境及腸道中的病原體逐漸成為一種相對于施用抗生素而言更好、更有效的辦法[19-20]。本研究所使用的有益菌液由光合細菌、保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、腸道有益菌3y621混合而成，每種有益菌在調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體與腸道微生態(tài)平衡方面各自發(fā)揮著獨特的功效。其中，光合細菌產(chǎn)生的抗病毒物質(zhì)與乳酸鏈球菌產(chǎn)生的嗜酸菌素對病原微生物有抑制作用[21]。保加利亞乳桿菌以某種免疫調(diào)節(jié)因子刺激腸道局部型免疫反應(yīng)，以提高機體抗體水平，增強其免疫力。有學(xué)者認為，分離自動物腸道的特有的益生菌更易定植于養(yǎng)殖動物的腸道，這可能是因為它們更容易適應(yīng)腸道內(nèi)特殊的環(huán)境。研究顯示，高濃度的某些益生菌對養(yǎng)殖動物會產(chǎn)生毒害作用[22]，今后有必要進一步探討不同濃度益生菌對養(yǎng)殖動物生長的影響。此外，益生菌不同施用方式是否也會影響益生菌的功效，應(yīng)進一步深入研究。

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