陳發(fā)波等

摘要：為了解我國(guó)西南地區(qū)不同玉米品種間的遺傳多樣性，對(duì)5份玉米地方品種的Waxy基因部分編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行克隆、測(cè)序及序列比對(duì)。結(jié)果表明，所選材料的Waxy基因序列長(zhǎng)度約為1 370 bp，一致性為96.60%，大于 3 bp 的插入/缺失有8個(gè)。不同地方品種材料間的遺傳相似系數(shù)在98.7%～99.6%之間，平均遺傳相似系數(shù)為992%，根據(jù)聚類圖將供試材料分為4類。說(shuō)明 Waxy基因具有較高的保守性，所選材料間存在一定的遺傳多樣性，利用Waxy基因序列可以將不同的玉米地方品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。Waxy基因序列可作為一種理想的分子標(biāo)記，用于今后玉米地方品種的研究。

關(guān)鍵詞：Waxy基因；玉米；地方品種；遺傳差異；保護(hù)利用

中圖分類號(hào)： S513.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0018-04

收稿日期：2013-10-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31371633）；重慶市教育委員會(huì)科技計(jì)劃（編號(hào)：KJ121304）；重慶市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)攻關(guān)（編號(hào)：CSTC2011AB1022）。

作者簡(jiǎn)介：陳發(fā)波（1981—），男，四川冕寧人，博士，副教授，從事作物遺傳育種研究。Tel：（023）72792193；E-mail：chenfabo963@126.com。

通信作者：姚啟倫，博士，教授，從事作物遺傳育種研究。Tel：（023）72792193；E-mail：yql641@aliyun.com。玉米（Zea mays L.）是我國(guó)除水稻以外的第二大農(nóng)作物，種植面積約占世界玉米種植面積的20%，總產(chǎn)量?jī)H次于美國(guó)。1940年之后，隨著雜交育種技術(shù)的發(fā)展，玉米產(chǎn)量有了較大的提高，但育種工作者在育種工作中對(duì)少數(shù)固定的玉米品種親本長(zhǎng)期連續(xù)自交選擇，使玉米之間的遺傳差異縮小，遺傳多樣性也嚴(yán)重退化，導(dǎo)致玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)出現(xiàn)了“瓶頸”現(xiàn)象[1]。例如，美國(guó)玉米雜交種親本完全來(lái)源于固定的6～8個(gè)原始親本，我國(guó)玉米雜交種親本也大都來(lái)自約20個(gè)固定的原始自交系[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)各地區(qū)的玉米地方品種變異程度高，具有豐富的遺傳多樣性，在育種方面具有較大的利用潛力，保護(hù)與利用玉米地方種質(zhì)資源成為玉米育種工作的重點(diǎn)。西南地區(qū)因其獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件仍有大量地方玉米品種，其蘊(yùn)藏著豐富的遺傳多樣性，是我國(guó)玉米種質(zhì)資源最豐富的地區(qū)之一。蔡一林等就玉米的品質(zhì)及表型對(duì)重慶地區(qū)710份地方品種進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，各地區(qū)不同玉米地方品種間的平均含油率無(wú)較大差異，而蛋白質(zhì)所占比例、株高和雄穗分枝數(shù)等表型性狀的差異較大，這為該地區(qū)玉米地方種質(zhì)資源的高效管理和合理利用提供了科學(xué)依據(jù)[5]。戴玄等選取武陵山區(qū)中具有特殊代表性的玉米地方品種和骨干玉米自交系品種各10個(gè)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，地方品種比骨干自交系產(chǎn)量更高，抗倒伏及抗病蟲(chóng)害能力更強(qiáng)，這為挖掘、利用優(yōu)良玉米地方品種種質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)[6]。姚啟倫等利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)四川及重慶玉米地方品種遺傳多樣性進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)玉米地方品種存在豐富的遺傳多樣性，這為其保護(hù)和利用提供了重要理論依據(jù)[7]。姚啟倫等還發(fā)現(xiàn)，云南和貴州玉米地方品種在DNA分子水平均表現(xiàn)出較高的遺傳變異特性[8]。張燕以西南高山地區(qū)的玉米地方品種為材料，采取完全隨機(jī)抽樣調(diào)查的方法研究了其堿基對(duì)序列之間的差異性，結(jié)果表明，西南高山地區(qū)的玉米地方品種種質(zhì)資源豐富，變異度顯著，遺傳差異大，因此在育種工作中具有較大利用潛力，同時(shí)為拓寬種質(zhì)基礎(chǔ)和豐富玉米的遺傳多樣性提供了可能[9]。

目前，鑒定、篩選優(yōu)良玉米地方種質(zhì)并在育種中加以利用是解決種質(zhì)基礎(chǔ)狹窄的重要途徑之一[10]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，人們可以直接從基因水平研究作物間的遺傳差異，指導(dǎo)作物的篩選與利用。許多基因序列已被作為分子標(biāo)記，用于植物遺傳多樣性及起源進(jìn)化的研究。玉米Waxy基因位于玉米第9染色體9.03位置，編碼顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶，決定玉米胚乳和花粉中的支鏈淀粉合成，是決定玉米胚乳淀粉類型和性質(zhì)的關(guān)鍵基因之一。Waxy基因?yàn)閱慰截愋蛄?，具有較高的保守性[11]。因此，本研究通過(guò)對(duì)5份玉米地方品種Waxy基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列比對(duì)，檢測(cè)西南地區(qū)不同玉米品種間的堿基序列差異，探討將Waxy基因應(yīng)用于玉米地方品種遺傳差異檢測(cè)的可能性，以期為今后玉米地方品種的保護(hù)與利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

在西南地區(qū)收集5個(gè)具有典型地方特色的玉米地方品種作為供試材料，材料編號(hào)、名稱及收集地見(jiàn)表1。并以NCBI網(wǎng)站所公布的玉米Waxy基因序列（GenBank編號(hào)為HQ423241.1）為對(duì)照。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取每個(gè)品種取15張新鮮單株葉片并混合，采用2×CTAB法提取基因組DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA原液的濃度及DNA的完整性。

1.2.2Waxy基因的克隆根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物信息網(wǎng)（CNBI）公布的Waxy基因堿基序列，采用Primer 5.0軟件合

Waxy基因作為單拷貝基因，序列相對(duì)保守，可作為分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記，已用于檢測(cè)植物間的遺傳差異及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。田孟良等對(duì)我國(guó)西南地區(qū)23份糯玉米品種的Waxy基因序列多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)糯玉米的核苷酸多態(tài)性較低，因此他們提出了育種工作應(yīng)從近緣物種中引入等位變異以提高玉米產(chǎn)量和淀粉質(zhì)量的觀點(diǎn)[11]。趙耀等對(duì)玉米Waxy基因密碼子偏好性和玉米GBSSⅠ蛋白編碼基因的密碼子偏好性進(jìn)行分析，并將Waxy基因的密碼子用法與真核表達(dá)系統(tǒng)、酵母兩類普遍采用的原核、大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行比較，得出了“通過(guò)對(duì)密碼子偏好性分析可為基因表達(dá)選擇適宜的表達(dá)系統(tǒng)”的結(jié)論，同時(shí)也為密碼子的改造、增加基因的表達(dá)量提供了較可靠的依據(jù)[12]。但是，真正將Waxy基因序列運(yùn)用于玉米種質(zhì)改良的實(shí)例還不多。雖然玉米地方品種中蘊(yùn)藏著巨大的遺傳變異性，但由于玉米地方品種繁多且許多品種間的親緣關(guān)系較近，不易利用常規(guī)分子標(biāo)記分析一系列品種間的遺傳差異。本研究通過(guò)對(duì)6個(gè)序列的比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同玉米地方品種間Waxy基因序列存在一定的遺傳變異性，說(shuō)明Waxy基因序列可用于玉米地方品種遺傳多樣性、分子進(jìn)化等方面的研究。

另外，筆者所在的課題組只選擇了5個(gè)地方玉米品種作為試驗(yàn)材料并對(duì)其Waxy基因進(jìn)行克隆和序列比對(duì)。因此，無(wú)法避免數(shù)據(jù)的片面性，在今后的研究中須要利用Waxy基因序列檢測(cè)更多的玉米地方品種，以充分利用這些材料。通過(guò)與NCBI中公布的序列進(jìn)行比對(duì)可以看出，所選材料中的Waxy基因序列與公布的序列有較高的一致性，進(jìn)一步證明Waxy基因具有較高的保守性，同時(shí)也存在一定的的遺傳變異位點(diǎn)。說(shuō)明Waxy基因具有較高的保守性，所選材料間Waxy基因序列存在一定的遺傳多樣性，Waxy基因序列可作為一種理想的分子標(biāo)記用于今后玉米地方品種的研究。

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[12]趙耀，劉漢梅，顧勇，等. 玉米Waxy基因密碼子偏好性分析[J]. 玉米科學(xué)，2008，16（2）：16-21.

另外，筆者所在的課題組只選擇了5個(gè)地方玉米品種作為試驗(yàn)材料并對(duì)其Waxy基因進(jìn)行克隆和序列比對(duì)。因此，無(wú)法避免數(shù)據(jù)的片面性，在今后的研究中須要利用Waxy基因序列檢測(cè)更多的玉米地方品種，以充分利用這些材料。通過(guò)與NCBI中公布的序列進(jìn)行比對(duì)可以看出，所選材料中的Waxy基因序列與公布的序列有較高的一致性，進(jìn)一步證明Waxy基因具有較高的保守性，同時(shí)也存在一定的的遺傳變異位點(diǎn)。說(shuō)明Waxy基因具有較高的保守性，所選材料間Waxy基因序列存在一定的遺傳多樣性，Waxy基因序列可作為一種理想的分子標(biāo)記用于今后玉米地方品種的研究。

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另外，筆者所在的課題組只選擇了5個(gè)地方玉米品種作為試驗(yàn)材料并對(duì)其Waxy基因進(jìn)行克隆和序列比對(duì)。因此，無(wú)法避免數(shù)據(jù)的片面性，在今后的研究中須要利用Waxy基因序列檢測(cè)更多的玉米地方品種，以充分利用這些材料。通過(guò)與NCBI中公布的序列進(jìn)行比對(duì)可以看出，所選材料中的Waxy基因序列與公布的序列有較高的一致性，進(jìn)一步證明Waxy基因具有較高的保守性，同時(shí)也存在一定的的遺傳變異位點(diǎn)。說(shuō)明Waxy基因具有較高的保守性，所選材料間Waxy基因序列存在一定的遺傳多樣性，Waxy基因序列可作為一種理想的分子標(biāo)記用于今后玉米地方品種的研究。

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