倫永志，孫 杰，駱 寧，姚曉坤，周士勝

（1. 大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 遼寧省高校生物物理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622；2. 大連港醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 遼寧 大連 116013）

代謝綜合征指一組多種代謝紊亂伴隨發(fā)生的集群，包括肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常等，是2 型糖尿病和心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素[1]。近年來，代謝綜合征的發(fā)病率不僅在成年人群中呈現(xiàn)指數(shù)增長，在青少年、兒童群體中也增長顯著[1]。雖然關(guān)于代謝綜合征發(fā)生的精確機(jī)制仍不清楚，但是逐漸增多的證據(jù)提示，氧化應(yīng)激[2]和甲基化代謝紊亂，如改變的血漿甲基供體[3]，同型半胱氨酸[4]和DNA 甲基化樣式[5]在代謝綜合征的形成過程中發(fā)揮重要作用。因此，從氧化應(yīng)激和不正常甲基化樣式方面尋找代謝綜合征的成因，將有助于闡明該病的病理機(jī)制。

尼亞新（維生素B3，煙酸或煙酰胺）作為一種主要的合成營養(yǎng)素，是NAD 和NADP 的前體物質(zhì)[6]，因此煙酰胺的代謝平衡對(duì)于維持細(xì)胞的正常功能非常重要。過量的煙酰胺攝入能夠觸發(fā)氧化應(yīng)激和胰島素抵抗[7,8]。在煙酰胺負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，煙酰胺攝入可以顯著抑制兒茶酚胺的降解[9]。由此我們推測，高煙酰胺攝入也將影響機(jī)體其他甲基化反應(yīng)。為了驗(yàn)證以上假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了長期煙酰胺大鼠喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以觀察煙酰胺喂養(yǎng)對(duì)機(jī)體甲基化反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康，雄性SD 大鼠，5 周齡，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于室溫和光照可控的飼養(yǎng)室內(nèi)（22±2°C，12/12 h: 6:00 a.m.到6:00 p.m.），自由進(jìn)食水。

1.2 主要試劑與儀器

煙酰胺（Sigma，美國）；N1-甲基煙酰胺（Osaka，日本）；N1-ethylnicotinamide，2Py（見文獻(xiàn)[10,11]合成）；同型半胱氨酸（Sigma，美國）；甜菜堿（Sigma，美國）；Hypersil ODS C18 column（Thermo，美國）；SupelcosilTMLC-SCX column（Supelco，美國）；Waters 470 fluorescence detector（Milford，美國）；UV3000 detector（Thermo，美國）；Bio-Rad model 550-microplate reader（Bio-Rad，美國）。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)及組織樣本采集

實(shí)驗(yàn)大鼠分為三組：對(duì)照組和兩個(gè)煙酰胺負(fù)荷組，兩個(gè)煙酰胺負(fù)荷組的鼠糧中分別加入煙酰胺1 或4 g /kg。喂養(yǎng)時(shí)間：20 周；飼養(yǎng)期間記錄每天飲食量，每周監(jiān)測體重、血糖，每4 周進(jìn)行一次糖耐量實(shí)驗(yàn)；煙酰胺負(fù)荷結(jié)束，20 %烏拉坦麻醉，后眼眶靜脈叢采血，EDTA 抗凝后離心收集血漿，-80°C 保存。

1.4 血漿學(xué)指標(biāo)測定

1.4.1 煙酰胺、N1-甲基煙酰胺、同型半胱氨酸、甜菜堿測定

樣品經(jīng)預(yù)處理后，加入標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)色譜分析。

煙酰胺、N1-甲基煙酰胺的流動(dòng)相配置及樣品檢測：10 mM 庚烷磺酸鈉，50 mM 三乙胺水溶液（pH 3.20），乙腈（78:22 v/v），0.45 μm 微孔濾膜過濾之后，超聲脫氣30 min；流速：1.0 mL/min；色譜柱：Hypersil ODS C18 column；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測器激發(fā)波長為366 nm，發(fā)射波長為418 nm。

同型半胱氨酸的流動(dòng)相配置和樣品檢測：含30 mL/L 甲醇的0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.6），0.45 μm 微孔濾膜過濾后，超聲脫氣30 min；流速0.8 mL/min；色譜柱：Hypersil ODS C18 column；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測器激發(fā)波長為385 nm，發(fā)射波長為515 nm。

甜菜堿的流動(dòng)相配置和樣品檢測：22 mmol/L 膽堿溶于100 mL/L 雙蒸水，加入900 mL/L 乙腈，0.45 μm 微孔濾膜過濾后，超聲脫氣30 min；流速1.2 mL/min；色譜柱：SupelcosilTMLC-SCX column；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測器檢測波長為254 nm。

1.4.2 膽堿測定

膽堿測定按照美國 Biovision 公司生產(chǎn)的Choline/Acetylcholine Quantification kit 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟完成，反應(yīng)生成物于Bio-Rad model 550 酶標(biāo)儀檢測，檢測波長570 nm。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±SD）表示，組間采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，P<0.05 顯著性差異。

2 結(jié)果

煙酰胺主要利用S-腺苷蛋氨酸介導(dǎo)的甲基化反應(yīng)，生成N1-甲基煙酰胺進(jìn)行代謝清除。如圖1 所示，大鼠煙酰胺超載的情況下，血漿煙酰胺（圖1A），N1-甲基煙酰胺（圖1B）和膽堿水平（圖1D）升高 ，血漿甜菜堿水平顯著下降（圖1E）。血漿同型半胱氨酸水平在1 g 煙酰胺喂養(yǎng)的狀況下略有下降，4 g 煙酰胺喂養(yǎng)的情況下略有上升（圖1C），這些結(jié)果均說明，高煙酰胺攝入所誘發(fā)的甲基耗竭，影響了機(jī)體的甲基代謝平衡。

圖1 尼克酰胺負(fù)荷后，血漿中煙酰胺、N1-甲基煙酰胺、同型半胱氨酸、膽堿與甜菜堿水平

棒狀圖：mean±SD；NM:尼克酰胺.；*P<0.05，**P<0.001 vs Control

3 討論

逐漸增多的證據(jù)顯示，氧化應(yīng)激[2]和異常的甲基化狀態(tài)[3-5]在代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。可以想象的是，飲食甲基供體的平衡（缺乏或者過量）將對(duì)機(jī)體甲基化反應(yīng)產(chǎn)生顯著的影響。因此，煙酰胺有可能通過誘導(dǎo)甲基耗竭來影響其他甲基化反應(yīng)，例如該研究中，煙酰胺喂養(yǎng)后，大鼠甲基供體甜菜堿含量顯著下降。相似的是，也有人研究發(fā)現(xiàn)，協(xié)同服用甜菜堿將緩解尼亞新耗竭S-腺苷蛋氨酸引起肝臟毒性[12]。有趣的是，當(dāng)大鼠喂養(yǎng)高水平煙酰胺時(shí)，血漿另一種甲基供體，膽堿水平顯著提升。一般來說，體內(nèi)膽堿水平的維持由多種途徑參與：如兩個(gè)膽堿獲取途徑（飲食攝入和PEMT 合成途徑）和兩個(gè)膽堿消耗途徑（膽堿氧化和膽汁磷脂酰膽堿分泌），因此任何一條膽堿獲取或代謝途徑出現(xiàn)異常，將顯著影響膽堿平衡[13]。由此我們推測，煙酰胺觸發(fā)的氧化應(yīng)激，可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜膽堿前體磷脂酰膽堿的釋放，進(jìn)而提高血漿膽堿水平。

值得注意的是，血漿同型半胱氨酸，在1 g 煙酰胺喂養(yǎng)的情況下呈降低趨勢，而在4 g 煙酰胺喂養(yǎng)的狀況下反而升高。一些相似的研究也發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸血癥在代謝綜合征中很少被觀察到，但在其最初的臨床結(jié)局中，如2 型糖尿病和心血管疾病中卻經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[1]。這些現(xiàn)象似乎也反映了，機(jī)體的同型半胱氨酸在向蛋氨酸或者胱硫醚轉(zhuǎn)換時(shí)具備自身調(diào)節(jié)能力，并且這種調(diào)節(jié)也受到許多因素的影響，如血漿同型半胱氨酸的水平被發(fā)現(xiàn)伴隨年齡的增加而升高[14,15]。并且，由于飲食是決定血漿同型半胱氨酸水平的主要因素[16]，因此代謝綜合征的患者，即使心血管疾病患者，在進(jìn)行低甲基消耗物質(zhì)飲食時(shí)，或者具備一個(gè)高效的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍彼崮芰Φ臅r(shí)候，其血漿同型半胱氨酸水平也將顯著降低。從該觀點(diǎn)和當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，血漿同型半胱氨酸水平似乎并不是一個(gè)能夠良好預(yù)測甲基供給和消耗間平衡的良好指標(biāo)。

煙酰胺的過量攝入誘導(dǎo)的甲基耗竭可能會(huì)干擾內(nèi)源性底物的甲基化代謝，例如影響DNA 甲基化和單胺神經(jīng)遞質(zhì)的甲基化滅活，因?yàn)樗械膬?nèi)源性和外源性底物共用相同的甲基供體庫進(jìn)行甲基化反應(yīng)。我們近期的研究證實(shí)，煙酰胺在進(jìn)行甲基化降解的同時(shí)，會(huì)通過抑制兒茶酚胺的甲基化清除，顯著增加了血漿兒茶酚胺濃度[9]。之后的研究提示，煙酰胺誘導(dǎo)的自由甲基缺乏將干擾DNA 的甲基化反應(yīng)，包括全基因組DNA 低甲基化和部分基因啟動(dòng)子核心調(diào)控區(qū)域甲基樣式的改變[17]。

[1] Zhou SS, Zhou YM, Li D, et al. Dietary methyl-consuming compounds and metabolic syndrome [J]. Hypertens Res, 2011, 34(12): 1239-1245.

[2] Roberts CK, Sindhu KK. Oxidative stress and metabolic syndrome [J]. Life Sci, 2009, 84(21-22): 705-712.

[3] Konstantinova SV, Tell GS, Vollset SE, et al. Divergent associations of plasma choline and betaine with components of metabolic syndrome in middle age and elderly men and women [J]. J Nutr, 2008, 138(5): 914-920.

[4] Dominguez LJ, Galioto A, Pineo A, et al. Age, homocysteine, and oxidative stress: relation to hypertension and type 2 diabetes mellitus [J]. J Am Coll Nutr, 2010, 29(1): 1-6.

[5] Gallou-Kabani C, Junien C. Nutritional epigenomics of metabolic syndrome: new perspective against the epidemic [J]. Diabetes, 2005, 54(7): 1899-1906.

[6] Li F, Chong ZZ, Maiese K. Cell Life versus cell longevity: the mysteries surrounding the NAD+ precursor nicotinamide [J]. Curr Med Chem, 2006, 13(8): 883-895.

[7] Li D, Sun WP, Zhou YM, et al. Chronic niacin overload may be involved in the increased prevalence of obesity in US children [J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(19): 2378-2387.

[8] Zhou SS, Li D, Zhou YM, et al. B-vitamin consumption and the prevalence of diabetes and obesity among the US adults: population based ecological study [J]. BMC Public Health, 2010, 10: 746.

[9] Sun WP, Li D, Lun YZ, et al. Excess nicotinamide inhibits methylation-mediated degradation of catecholamines in normotensives and hypertensives [J]. Hypertens Res, 2012, 35(2): 180-185.

[10] Hirayama T, Yoshida K, Uda K, et al. High-performance liquid chromatographic determination of N1- alkylnicotina- mide in urine [J]. Anal Biochem, 1985, 147(1): 108-113.

[11] Holman WI, Wiegand C. The chemical conversion of nicotinic acid and nicotinamide to derivatives of N-methyl- 2-pyridone by methylation and oxidation [J]. Biochem J, 1948, 43(3): 423-426.

[12] McCarty MF. Co-administration of equimolar doses of betaine may alleviate the hepatotoxic risk associated with niacin therapy [J]. Med Hypotheses, 2000, 55(3): 189-194.

[13] Craig SA. Betaine in human nutrition [J]. Am J Clin Nutr, 2004, 80(3): 539-549.

[14] Strassburg A, Krems C, Luhrmann PM, et al. Effect of age on plasma homocysteine concentrations in young and elderly subjects considering serum vitamin concentrations and different lifestyle factors [J]. Int J Vitam Nutr Res, 2004, 74(2): 129-136.

[15] Powers RW, Majors AK, Lykins DL, et al. Plasma homocy- steine and malondialdehyde are correlated in an age-and gender-specific manner [J]. Metabolism, 2002, 51(11): 1433-1438.

[16] Appel LJ, Miller ER, 3rd, Jee SH, et al. Effect of dietary patterns on serum homocysteine: results of a randomized, controlled feeding study [J]. Circulation, 2000, 102(8): 852-857.

[17] Li D, Tian YJ, Guo J, et al. Nicotinamide supplementation induces detrimental metabolic and epigenetic changes in developing rats [J]. Br J Nutr, 2013, 110(12): 2156-2164.