高 娜 景 明 張艷霞 王雅莉 陳正君

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院定西校區(qū)，甘肅 蘭州 743000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年結(jié)腸癌的新增人數(shù)高達(dá)120 萬，死亡患者約60.87 萬［1］，嚴(yán)重威脅著人們的生活與健康。而在北美、歐洲各國，結(jié)腸癌的死亡率在癌癥死亡原因中高居第2 位［2］。隨著我國人民生活水平的改善和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢［3］。目前，雖然西藥在以外科手術(shù)為主的綜合治療方面取得了一定的進(jìn)展，但其5 年生存率仍維持在50%左右［4］，導(dǎo)致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因是腫瘤的易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性及其耐藥性［5，6］;其次是治療結(jié)腸癌化療藥物的較大毒副作用。因此，進(jìn)一步深入探討結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，探尋低毒有效的抗腫瘤藥物是當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)課題，也是腫瘤防治工作者面臨的迫切任務(wù)之一。

藏藥濕生扁蕾具有清熱解毒、健脾止瀉的功效，藏醫(yī)用全草治療腸炎、痢疾、腹瀉等疾病在臨床上取得了很好的療效［7］。近年來，隨著對濕生扁蕾有效成分研究的深入，其功效也不斷被發(fā)現(xiàn)。有研究表明，濕生扁蕾提取物能夠抑制動物體內(nèi)S180 肉瘤及其它瘤株的生長［8］，此藥中的1 -羥基-3，7，8 -三甲氧基口 山 酮及1，7 -二羥基-3，8 -二甲氧基口 山 酮對卵巢癌細(xì)胞HO -8910 也具有毒性作用［9］。本實(shí)驗(yàn)研究藏藥濕生扁蕾影響SW480 細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子Bcl -2 及Bax 的mRNA 表達(dá)，并探討其相關(guān)機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療和新藥開發(fā)開拓思路。

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)藥物: 藏藥濕生扁蕾提取物的制備: 取濕生扁蕾藥材，粉碎，過四號篩，稱取粉末100g，加15 倍量70%乙醇回流提取1.5h，濾取藥液，藥渣再用12 倍量70%乙醇回流提取1.5h，合并兩次藥液，濾過，濾液回收乙醇后備用。藥渣揮盡乙醇，加12 倍量水煎煮1.5h，濾過，濾液減壓濃縮后與醇提浸膏合并，冷凍干燥，即得。

濕生扁蕾提取物供試液的制備: 稱取濕生扁蕾提取物50 mg，用0.02%二甲基亞砜溶解，抽濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｐ枰獣r(shí)(用生理鹽水)稀釋至工作液。

1.2 細(xì)胞株: 人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株購自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。

1.3 試劑: DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone 公司);胎牛血清(FBS，Hyclone 公司);0.25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone 公司);二甲亞砜(DMSO，Gibco 公司);PBS(磷酸鹽緩沖液，Hyclone公司);Trizol 試劑盒(Invitrogen 公司);RT 試劑盒和PCR試劑盒(Promega 公司);PCR 引物(上海英俊生物有限公司)。

1.4 儀器: 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus 公司);9600 型PCR 儀(美國PE 公司);Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統(tǒng);5417R 高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf 公司);APC 300 型電泳儀和水平式電泳槽(美國Bio-Rad 公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 SW480 細(xì)胞的培養(yǎng): 采用常規(guī)培養(yǎng)SW480 細(xì)胞，培養(yǎng)液為含有10% 小牛血清及青、鏈霉素各100u/ml DMEM液，在37℃，飽和濕度，5%CO2 孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞單層貼壁生長至80% ～90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶/EDTA 消化后傳代培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT-PCR 法檢測Bc1 -2 和Bax 的mRNA 表達(dá): 對數(shù)生長期的SW480 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)量約為2 ×105 個(gè)/孔，24 h 后分別以不同濃度(250、500、1000 μg/ml)的濕生扁蕾提取物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，提取每組總RNA。

2.2.1 細(xì)胞總RNA 的提取: 按照Trizol 試劑盒說明方法進(jìn)行，隨后取2μgRNA 按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒要求配制反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物置于-20℃保存，用于PCR 擴(kuò)增。

2.2.2 目的基因PCR 擴(kuò)增: 在NCBI 上查目的基因全序列，利用Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列。Bcl -2: F: 5' -CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT - 3'，R: 5' - GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-3';Bax: F: 5' -TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3'，R: 5' -TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-3';GAPDH: F: 5' - CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA-3'，R: 5' - AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG-3';β-actin: F: 5`-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCCTA-3`，R: 5`-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3`。取cDNA 1.0?l，加10 × Taq Buffer2. 0?l，25 mM Mg2 + 1. 2?l，10 mM dNTP0.4?l，上下游引物各0.4?l，1U/mlTaq 酶0.6?l，DEPC 水14.0?l 配成20?l 的總反應(yīng)體積。在95℃預(yù)變性3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35 個(gè)循環(huán)，72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存，用于瓊脂糖凝膠電泳。

2.2.3 PCR 產(chǎn)物表達(dá): 取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，加2μl 的loading buffer(6 ×)充分混勻后加到1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，通電，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿后停止電泳。

結(jié)果表明，SW480 細(xì)胞經(jīng)不同濃度濕生扁蕾處理24 h后，Bcl-2 mRNA 的表達(dá)隨濃度增加而減少，而Bax mRNA表達(dá)隨濃度增加而增多，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。濕生扁蕾對SW480 細(xì)胞Bcl -2 mRNA 及BaxmRNA 表達(dá)的電泳圖見圖1、圖2。

圖1 濕生扁蕾對SW480 細(xì)胞Bcl-2mRNA及BaxmRNA 表達(dá)的電泳圖(內(nèi)參GAPDH)

圖2 濕生扁蕾對SW480 細(xì)胞Bcl-2 mRNA及BaxmRNA 表達(dá)的電泳圖(內(nèi)參β-actin)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程，適度適時(shí)的細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)的重要手段，而如果凋亡失調(diào)就會影像機(jī)體的正常生長、發(fā)育，并可導(dǎo)致各種疾病［10］。腫瘤是機(jī)體在各種滯留因素的作用下，細(xì)胞生長調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂、細(xì)胞異常增殖而形成的新生物，常表現(xiàn)為局部的異常組織團(tuán)塊［11］。

目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡不足密切相關(guān)。Bcl-2 家族的成員是高等動物中生存和死亡信號重要的整合因子。該家族成員分為三大類，抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-XL 等;促凋亡基因，如Bax、Bak 等;雙向調(diào)控基因，如c-myc，Bclx［12］。其中Bcl-2 和Bax 表達(dá)的比例是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵。Bcl -2 本身的活性受相關(guān)蛋白Bax的調(diào)節(jié)，Bax 增高時(shí)能和Bcl -2 形成異二聚體(Bcl -2 -Bax)，抑制Bcl-2 的功能從而抑制細(xì)胞凋亡，反之則形成二聚體(Bax-Bax)誘導(dǎo)凋亡［13，14］。因此，Bax/Bcl-2 的比例決定了細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性，最終決定了細(xì)胞的生存和死亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏藥濕生扁蕾作用結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞24 h 后，Bcl -2 mRNA 的表達(dá)減少，而Bax mRNA 表達(dá)增多，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。說明濕生扁蕾引起凋亡基因Bcl-2、Bax 表達(dá)的變化可能是其促進(jìn)SW480 細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，而通過濕生扁蕾對SW480 細(xì)胞Bcl -2、Bax 表達(dá)的的調(diào)節(jié)可能有助于改善結(jié)腸癌患者的病情及生存狀況。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et a1.Global Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2) ：69 -90.

［2］Sanoff HK，Sargent DJ，Campbell ME，et al. Five -year data and prognostic factor analysis of oxaliplatin and irinotecan combinations for advanced colorectal cancer： N9741［J］.J Clin Oncol，2008，26(35) ： 5721 -5727.

［3］李寶國.結(jié)腸癌診治的回顧與展望［J］. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31(13) ：2124 -2125.

［4］Ransohoff DF. How much does colonoscopy reduce colon cancer mortality［J］. Ann Intern Med，2009，150(1) ：50-52.

［5］Efremidou EI，Liratzopoulos N，Papageorgiou SM，et a1.Colorectal carcinoma：correlation between age，gender and subsite distribution［J］. Chirurgia( Bucur) ，2008，103(6) ：659 -663.

［6］Kingham TP，Pachter HL. Colonic anastomotic leak： risk factors，diagnosis，and Treatment［J］. J Am Coll Surg，2009，208(6) ：1152 -1153.

［7］王煥弟，譚成玉，白雪芳，等.藏藥濕生扁蕾的抑菌作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)藥，2006，17(10) ：190.

［8］張寶琛，甄潤德，胡柏林等. 濕生扁蕾化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，1980，11：149 -151.

［9］米琴，曹長年，趙宙興，等. 藏藥濕生扁蕾有效成份的研究［J］.青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版) ，2005，2：64 -66.

［10］ang JZ，Chen GQ. Textbook of Pathophysiology ( M)2006； 12：154 -165.

［11］李玉林.病理學(xué)［M］. 第7 版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008. 5：76 -77.

［12］Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis［J］. Mol Cell Biochem，2011，351(1 -2) ：41 -58.

［13］樊蔚虹，姚建平，趙文景. 柴胡疏肝散對卒中后抑郁大鼠海馬組織Bcl-2，Bax 蛋白表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(3) ：181 -183.

［14］張力，龔明玉，李毅學(xué)，等. 放療聯(lián)合熱療誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡及其與Bcl -2 和Bax 蛋白表達(dá)關(guān)系的研究［J］. 中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14( 2C) ： 627 -630.