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        民間草藥臭靈丹抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究△

        2014-07-09 01:51:18呂躍軍華木星龍海瓊包賽朵
        中國民族醫(yī)藥雜志 2014年9期
        關(guān)鍵詞:靈丹銅綠埃希菌

        孫 燕 呂躍軍 華木星 龍海瓊 包賽朵

        ( 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671003)

        臭靈丹草Laggera pterodonta(DC.)Benth.為菊科六棱菊屬翼齒六棱菊,別名獅子草、臭葉子、六棱菊等,主要分布于我國長江流域以南及西南部[1]。主要化學(xué)成分為桉烷型倍半萜和黃酮類化合物,具有抗菌消炎、清熱解毒及抗腫瘤等作用[2]。臭靈丹在云南大理白族自治州各地均有分布。主要用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、支氣管炎、癰腫疥瘡、燒燙傷、毒蛇咬傷、跌打損傷[3]。對臭靈丹乙醇提取物抑菌作用的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本文通過臭靈丹乙醇提取物抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究,比較臭靈丹莖、葉等不同部位的乙醇提取物對不同細(xì)菌的抑制效果,為臭靈丹藥物療效的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料、試劑與儀器

        1.1 材料: 臭靈丹購自昆明市官渡區(qū)綠生藥業(yè)有限公司;金黃色葡萄球菌(S.aureus)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、大腸埃希菌(E.coli)由大理學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.2 試劑: 95%乙醇為分析純(天津市化學(xué)試劑廠);MH(A)培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);MH 肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司);氯化鈉(原天津市化學(xué)試劑三廠)。

        1.3 儀器: SY8200T 型超聲波清洗器(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司);RE52 -3 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海瀘西分析儀器有限公司);GHP-9160 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器科學(xué)有限公司);JJ -CJ -2FD 超凈工作臺(tái)(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司);YXQ -LS -50SII 型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);JA3102 電子天平(上海海康電子儀器廠);DP04224 微量加樣槍;50 分度游標(biāo)卡尺。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 臭靈丹乙醇提取物制備: 稱取臭靈丹粉末葉1400g、莖2000g,用95%乙醇(藥材的10 倍量)超聲波處理1h,靜置5min,過濾,濾渣用95%乙醇(藥材的2 倍量)超聲波處理30min,靜置5min,過濾,收集兩次濾液,減壓濃縮至無醇味。

        在臭靈丹濃縮乙醇提取液中加入多倍量水稀釋,放置4℃的冰箱6h 后過濾,沉淀物除去樹脂,葉綠素等水不溶性雜質(zhì),減壓濃縮得到流浸膏[4],莖為106.10g,提取率為5.305%;葉為113.70g,提取率為8.121%。

        以20%乙醇作溶劑溶解臭靈丹乙醇提取物莖、葉,配制成所需濃度[5]。

        2.2 菌懸液的制備: 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌分別接種于MH 瓊脂平板培養(yǎng)基中,于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取瓊脂平板上活化的單個(gè)菌落,用5 ~6mL 生理鹽水校正濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷釂挝弧?/p>

        2.3 濾紙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)研究臭靈丹相對抑菌活性: 用軋孔器在定性濾紙上軋成直徑為6mm 的小圓片數(shù)片,于120℃條件下高壓滅菌20min。取圓形滅菌濾紙片放入分別裝有臭靈丹莖(1g/mL)、葉(1g/mL)提取液及20%乙醇的試管中浸潤,用無菌鑷子取出含藥濾紙片放入培養(yǎng)皿于恒溫箱中烘干5min,備用。

        各菌種設(shè)2 個(gè)平行組,臭靈丹莖、葉兩組為實(shí)驗(yàn)組,不含藥液的溶劑為對照組。用無菌棉簽取已配制好的菌懸液,于MH 瓊脂平板上作來回連續(xù)劃線,使其密集而均勻地涂布于整個(gè)平板表面,置室溫3 ~5min 后。用無菌鑷子分別取實(shí)驗(yàn)組及對照組含藥紙片呈對稱三角形貼于細(xì)菌平板上。同法取其他細(xì)菌各做1 份,并在平板底面玻璃上注明細(xì)菌及藥物名稱,于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h 后觀察并記錄結(jié)果。

        2.4 試管稀釋法測量臭靈丹對測試菌的最低抑菌濃度(MIC): 各菌種設(shè)兩個(gè)平行組,實(shí)驗(yàn)組為臭靈丹莖、葉醇提物兩組,對照組為不含藥液的溶劑,取10 支試管為一組,編為1 ~10 號,每支試管加入2mLMH 肉湯培養(yǎng)基,在莖組、葉組、對照組1 號試管中分別加入2mL 的4g/mL、2g/mL 制備藥液及20%乙醇溶液,混勻后分別吸取2mL 至2 號試管,以此類推加至8 號試管,吸取2mL 棄去。9 號試管為不含藥液的測試菌生長對照,10 號試管為不含菌液的陰性對照。莖組1 ~8 號試管藥液濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156g/mL;葉組1 ~8 號試管藥液濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078g/mL。用微量加樣器分別取0.1mL 菌懸液依次加到由低濃度藥液到高濃度藥液的各試管中(同法用于各菌)。將每組試管置于37°C 恒溫箱中培養(yǎng)24h,未見細(xì)菌生長的為最低抑菌濃度(MIC)。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 臭靈丹醇提物的抑菌作用: 見表1。

        表1 臭靈丹提取物平均抑菌圈直徑( ±s,mm n=5)

        表1 臭靈丹提取物平均抑菌圈直徑( ±s,mm n=5)

        組別 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌莖醇提物8.916 ±0.113 7.916 ±0.466 6.506 ±0.128葉醇提物 12.712 ±1.008 7.868 ±0.185 6.730 ±0.073溶劑對照組6.706 ±0.087 6.222 ±0.041 6.276 ±0.043

        對金黃色葡萄球菌: 莖組和乙醇溶劑組的抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);莖組抑菌圈直徑均值更大(8.92mm >6.71mm),有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(12.71mm >6.71mm),有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(12.71mm >8.92mm),葉醇提物抑菌作用比莖更明顯。

        對銅綠假單胞菌: 莖組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)莖組抑菌圈直徑均值更大(7.92mm >6.22mm),具有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),葉組的抑菌圈直徑均值更大(7.87mm >6.22mm),具有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.798 >0.05),莖、葉醇提物抑菌作用無顯著性差異。

        對大腸埃希菌: 莖組和乙醇溶劑組的抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01 <0.05)且莖組抑菌圈直徑均值更大(6.51mm >6.28mm),莖醇提物具有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(6.73mm >6.28mm);葉醇提物具有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02 <0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大6.73mm >6.51mm。葉醇提物抑菌作用比莖更明顯。

        3.2 莖、葉提取物對3 種菌的最小抑菌濃度(MIC): 在莖組實(shí)驗(yàn)中,金黃色葡萄球菌的澄清管為1 ~2 號,混濁管為3 ~9 號,MIC 為2 號管濃度,即為1g/mL;銅綠假單胞菌的澄清管為1 ~2 號,混濁管為3 ~9 號,MIC 為2 號管濃度,即為1g/mL;大腸埃希菌的澄清管為1 號,混濁管為2 ~9號,MIC 為1 號管濃度,即為2g/mL。

        在葉組實(shí)驗(yàn)中,金黃色葡萄球菌的澄清管為1 ~4 號,混濁管為5 ~9 號,MIC 為4 號管濃度,即為0.125g/mL;銅綠假單胞菌的澄清管為1 ~2 號,混濁管為3 ~9 號,MIC 為2 號管濃度,即為0.5g/mL;大腸埃希菌的澄清管為1 ~2號,混濁管為3 ~9 號,MIC 為2 號管濃度,即為0.5g/mL。

        在乙醇溶劑對照組實(shí)驗(yàn)中,僅金黃色葡萄球菌的1 號管與銅綠假單胞桿菌的1 號管曾出現(xiàn)過澄清溶液,其余管溶液皆混濁。因此,能進(jìn)一步支持本實(shí)驗(yàn)忽略溶劑對抗菌效果測定的干擾。

        4 結(jié) 論

        本研究顯示: 臭靈丹醇提物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有抑菌作用,對金黃色葡萄球菌抑菌作用較強(qiáng),對大腸埃希菌的抑菌作用較弱;臭靈丹葉醇提物的抑菌作用強(qiáng)于莖醇提物,臨床上葉入藥可以獲得更好的抑菌療效。

        [1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志( 第75卷) [M].北京:科學(xué)出版社,1979.46.

        [2]趙杰,毛曉健,楊天梅,等.淺談臭靈丹的藥理作用[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2008,2(8) : 14.

        [3]姜北,段寶忠.白族慣用植物藥[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2014.324 -326.

        [4]吳立軍.天然藥物化學(xué)( 第六版) [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社,2011.24.

        [5]邊藏麗,邊麗梅.乙醇對常見病原菌最低殺菌濃度的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華臨床醫(yī)藥雜志,2002,3(6) :41 -42.

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