孫 燕 呂躍軍 華木星 龍海瓊 包賽朵

( 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671003)

臭靈丹草Laggera pterodonta(DC.)Benth.為菊科六棱菊屬翼齒六棱菊，別名獅子草、臭葉子、六棱菊等，主要分布于我國長江流域以南及西南部［1］。主要化學(xué)成分為桉烷型倍半萜和黃酮類化合物，具有抗菌消炎、清熱解毒及抗腫瘤等作用［2］。臭靈丹在云南大理白族自治州各地均有分布。主要用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、支氣管炎、癰腫疥瘡、燒燙傷、毒蛇咬傷、跌打損傷［3］。對臭靈丹乙醇提取物抑菌作用的研究尚未見相關(guān)報道。本文通過臭靈丹乙醇提取物抑菌作用的實驗研究，比較臭靈丹莖、葉等不同部位的乙醇提取物對不同細菌的抑制效果，為臭靈丹藥物療效的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料: 臭靈丹購自昆明市官渡區(qū)綠生藥業(yè)有限公司;金黃色葡萄球菌(S.aureus)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、大腸埃希菌(E.coli)由大理學(xué)院病原生物學(xué)綜合實驗室提供。

1.2 試劑: 95%乙醇為分析純(天津市化學(xué)試劑廠);MH(A)培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);MH 肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司);氯化鈉(原天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.3 儀器: SY8200T 型超聲波清洗器(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司);RE52 -3 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海瀘西分析儀器有限公司);GHP-9160 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器科學(xué)有限公司);JJ -CJ -2FD 超凈工作臺(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司);YXQ -LS -50SII 型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);JA3102 電子天平(上海?？惦娮觾x器廠);DP04224 微量加樣槍;50 分度游標卡尺。

2 實驗方法

2.1 臭靈丹乙醇提取物制備: 稱取臭靈丹粉末葉1400g、莖2000g，用95%乙醇(藥材的10 倍量)超聲波處理1h，靜置5min，過濾，濾渣用95%乙醇(藥材的2 倍量)超聲波處理30min，靜置5min，過濾，收集兩次濾液，減壓濃縮至無醇味。

在臭靈丹濃縮乙醇提取液中加入多倍量水稀釋，放置4℃的冰箱6h 后過濾，沉淀物除去樹脂，葉綠素等水不溶性雜質(zhì)，減壓濃縮得到流浸膏［4］，莖為106.10g，提取率為5.305%;葉為113.70g，提取率為8.121%。

以20%乙醇作溶劑溶解臭靈丹乙醇提取物莖、葉，配制成所需濃度［5］。

2.2 菌懸液的制備: 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌分別接種于MH 瓊脂平板培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，用接種環(huán)取瓊脂平板上活化的單個菌落，用5 ～6mL 生理鹽水校正濃度至0.5 麥氏比濁單位。

2.3 濾紙擴散實驗研究臭靈丹相對抑菌活性: 用軋孔器在定性濾紙上軋成直徑為6mm 的小圓片數(shù)片，于120℃條件下高壓滅菌20min。取圓形滅菌濾紙片放入分別裝有臭靈丹莖(1g/mL)、葉(1g/mL)提取液及20%乙醇的試管中浸潤，用無菌鑷子取出含藥濾紙片放入培養(yǎng)皿于恒溫箱中烘干5min，備用。

各菌種設(shè)2 個平行組，臭靈丹莖、葉兩組為實驗組，不含藥液的溶劑為對照組。用無菌棉簽取已配制好的菌懸液，于MH 瓊脂平板上作來回連續(xù)劃線，使其密集而均勻地涂布于整個平板表面，置室溫3 ～5min 后。用無菌鑷子分別取實驗組及對照組含藥紙片呈對稱三角形貼于細菌平板上。同法取其他細菌各做1 份，并在平板底面玻璃上注明細菌及藥物名稱，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h 后觀察并記錄結(jié)果。

2.4 試管稀釋法測量臭靈丹對測試菌的最低抑菌濃度(MIC): 各菌種設(shè)兩個平行組，實驗組為臭靈丹莖、葉醇提物兩組，對照組為不含藥液的溶劑，取10 支試管為一組，編為1 ～10 號，每支試管加入2mLMH 肉湯培養(yǎng)基，在莖組、葉組、對照組1 號試管中分別加入2mL 的4g/mL、2g/mL 制備藥液及20%乙醇溶液，混勻后分別吸取2mL 至2 號試管，以此類推加至8 號試管，吸取2mL 棄去。9 號試管為不含藥液的測試菌生長對照，10 號試管為不含菌液的陰性對照。莖組1 ～8 號試管藥液濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156g/mL;葉組1 ～8 號試管藥液濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078g/mL。用微量加樣器分別取0.1mL 菌懸液依次加到由低濃度藥液到高濃度藥液的各試管中(同法用于各菌)。將每組試管置于37°C 恒溫箱中培養(yǎng)24h，未見細菌生長的為最低抑菌濃度(MIC)。

3 結(jié)果與討論

3.1 臭靈丹醇提物的抑菌作用: 見表1。

表1 臭靈丹提取物平均抑菌圈直徑( ±s，mm n=5)

表1 臭靈丹提取物平均抑菌圈直徑( ±s，mm n=5)

組別 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌莖醇提物8.916 ±0.113 7.916 ±0.466 6.506 ±0.128葉醇提物 12.712 ±1.008 7.868 ±0.185 6.730 ±0.073溶劑對照組6.706 ±0.087 6.222 ±0.041 6.276 ±0.043

對金黃色葡萄球菌: 莖組和乙醇溶劑組的抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);莖組抑菌圈直徑均值更大(8.92mm ＞6.71mm)，有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(12.71mm ＞6.71mm)，有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(12.71mm ＞8.92mm)，葉醇提物抑菌作用比莖更明顯。

對銅綠假單胞菌: 莖組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)莖組抑菌圈直徑均值更大(7.92mm ＞6.22mm)，具有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，葉組的抑菌圈直徑均值更大(7.87mm ＞6.22mm)，具有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.798 ＞0.05)，莖、葉醇提物抑菌作用無顯著性差異。

對大腸埃希菌: 莖組和乙醇溶劑組的抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01 ＜0.05)且莖組抑菌圈直徑均值更大(6.51mm ＞6.28mm)，莖醇提物具有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(6.73mm ＞6.28mm);葉醇提物具有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02 ＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大6.73mm ＞6.51mm。葉醇提物抑菌作用比莖更明顯。

3.2 莖、葉提取物對3 種菌的最小抑菌濃度(MIC): 在莖組實驗中，金黃色葡萄球菌的澄清管為1 ～2 號，混濁管為3 ～9 號，MIC 為2 號管濃度，即為1g/mL;銅綠假單胞菌的澄清管為1 ～2 號，混濁管為3 ～9 號，MIC 為2 號管濃度，即為1g/mL;大腸埃希菌的澄清管為1 號，混濁管為2 ～9號，MIC 為1 號管濃度，即為2g/mL。

在葉組實驗中，金黃色葡萄球菌的澄清管為1 ～4 號，混濁管為5 ～9 號，MIC 為4 號管濃度，即為0.125g/mL;銅綠假單胞菌的澄清管為1 ～2 號，混濁管為3 ～9 號，MIC 為2 號管濃度，即為0.5g/mL;大腸埃希菌的澄清管為1 ～2號，混濁管為3 ～9 號，MIC 為2 號管濃度，即為0.5g/mL。

在乙醇溶劑對照組實驗中，僅金黃色葡萄球菌的1 號管與銅綠假單胞桿菌的1 號管曾出現(xiàn)過澄清溶液，其余管溶液皆混濁。因此，能進一步支持本實驗忽略溶劑對抗菌效果測定的干擾。

4 結(jié) 論

本研究顯示: 臭靈丹醇提物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有抑菌作用，對金黃色葡萄球菌抑菌作用較強，對大腸埃希菌的抑菌作用較弱;臭靈丹葉醇提物的抑菌作用強于莖醇提物，臨床上葉入藥可以獲得更好的抑菌療效。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志( 第75卷) ［M］.北京：科學(xué)出版社，1979.46.

［2］趙杰，毛曉健，楊天梅，等.淺談臭靈丹的藥理作用［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2(8) ： 14.

［3］姜北，段寶忠.白族慣用植物藥［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2014.324 -326.

［4］吳立軍.天然藥物化學(xué)( 第六版) ［M］. 北京： 人民衛(wèi)生出版社，2011.24.

［5］邊藏麗，邊麗梅.乙醇對常見病原菌最低殺菌濃度的實驗研究［J］.中華臨床醫(yī)藥雜志，2002，3(6) ：41 -42.