支小軍 韓麗莎 韓 喆 劉 佳 宋 芳 胡 海 左春發(fā)

(1.包鋼醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；3.包頭市第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；4.包頭醫(yī)學(xué)院2008 級(jí)臨床本科班，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

抑郁癥發(fā)病原因復(fù)雜，缺乏有效的治療是當(dāng)前急待解決的問(wèn)題。神經(jīng)影像學(xué)發(fā)現(xiàn)患者腦海馬部位密度下降，神經(jīng)元的樹(shù)突減少和神經(jīng)元壞死。腦海馬與情緒和認(rèn)知關(guān)系密切，與抑郁障礙的關(guān)系受到關(guān)注［1］。在海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中S100β(酸性鈣結(jié)合蛋白)是腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞完整性的特異標(biāo)記蛋白，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損害反應(yīng)極為敏感［2］。本研究應(yīng)用慢性不可預(yù)知的溫和應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)建立抑郁模型，觀察蒙藥其察日嘎納對(duì)抑郁大鼠抑郁程度、腦海馬S100β 蛋白表達(dá)的干預(yù)作用，揭示蒙藥對(duì)抑郁癥的作用機(jī)制，為深入研究和防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料: 河北康派中藥材有限公司提供內(nèi)蒙產(chǎn)蒙藥其察日嘎納果實(shí)，批號(hào): 103151 ，粉碎后全成分入藥，生理鹽水配制為10%濃度，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 分組及實(shí)驗(yàn)方法: Wistar 成年大鼠36 只，包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供，雌雄各半，體重150 ～255g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后根據(jù)體重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、蒙藥組(抑郁模型+藥物)，每組12 只。對(duì)照組不予任何刺激，模型組、蒙藥組接受5w 的CUMS 建立抑郁模型。第6w 蒙藥組其察日嘎納每日灌胃1 次，O.1g/100g 體重;模型組及對(duì)照組灌服等量生理鹽水。

1.3 抑郁模型建立: 接受CUMS 的大鼠每日隨機(jī)給予一種刺激: 禁食(24h)、禁水(24h)、傾斜籠子(45 度斜，24h)、夾尾(1min)、束縛(8min)、電擊足底(電流1mA，每次持續(xù)5s，共15 次)，搖晃(1 次/s，5min)、噪音(5min)，共5w，相同的刺激不連續(xù)出現(xiàn)。

2 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)11w，進(jìn)行抑郁程度檢測(cè)、免疫組化染色觀察海馬S100β 蛋白的表達(dá)。

2.1 抑郁程度檢測(cè)

2.1.1 Open- Field 實(shí)驗(yàn): 安靜環(huán)境將大鼠放入80cm ×80cM 的開(kāi)闊箱的中央格，開(kāi)始計(jì)時(shí)。記錄大鼠5 min 內(nèi)行為，每只大鼠僅做1 次開(kāi)闊箱行為測(cè)定。觀察指標(biāo): 穿格次數(shù)(三爪以上跨入鄰格的次數(shù));理毛時(shí)間(前肢向上抬舉，洗臉、抓癢，舔足時(shí)間);站立次數(shù)。

2.1.2 tail–puspension 實(shí)驗(yàn): 用粘膏條在距尾尖2 cm 處將大鼠尾粘在一側(cè)懸繩的下端，鼠頭部離地面30 cm ，記錄鼠在3 分鐘內(nèi)的懸尾不動(dòng)時(shí)間、扭體次數(shù)。

2.2 海馬S100β 蛋白表達(dá)

2.2.1 取材及免疫組化: 大鼠1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(1mL/kg)，腹主動(dòng)脈、下腔靜脈插管，37℃0.9%的生理鹽水200 ml 快速灌注沖洗，37℃10%甲醛溶液400 mL 先快后慢進(jìn)行沖洗，開(kāi)顱取腦海馬，4%多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脫水，透明，包埋，冠狀切片(片厚約10μm)。常規(guī)二甲苯脫蠟乙醇水化，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。試劑: ①鼠抗S100B 單克隆抗體 濃縮型0.1 mL，克隆號(hào)SH -B1，工作濃度為1 B100;②DAB試劑盒顯色染色和切片由武漢博士德生物工程有限公司完成。

2.2.2 結(jié)果判定: 對(duì)各組切片(每組取3 張)染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組海馬各區(qū)分別隨機(jī)選10 個(gè)視野，取平均值。每個(gè)點(diǎn)取3 張片，每片取連續(xù)不重復(fù)的10 個(gè)視野，平均計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

2.2.3 圖像分析: 麥克奧迪圖像分析系統(tǒng)，觀察平均灰度、平均光密度及面密度，灰度和光密度顯示染色強(qiáng)度，面密度顯示陽(yáng)性面積。每張切片在40 倍物鏡下測(cè)量海馬CA1 區(qū)、CA2 區(qū)、CA3 區(qū)、CA4 區(qū)和DG 區(qū)［3］，取平均值反映切片值。

3 統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)以s 表示，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11. 0 進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 果

4.1 動(dòng)物模型界定: CUMS 刺激5w，大鼠表現(xiàn)為倦怠、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩、活動(dòng)范圍縮小、飲水和攝食減少。在給予刺激后第5w 取24h 尿，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定測(cè)定尿皮質(zhì)醇水平(nmol/24h): 模型組(38.1 ±10.9)、藥物組(37.9 ±9.2)，均明顯高于對(duì)照組(32.2 ± 9.6)(P＜0.05)，提示大鼠處于抑郁狀態(tài)，動(dòng)物模型建立。

4.2 抑郁程度比較: 藥物組與模型組比較: 穿格次數(shù)和站立次數(shù)明顯增加(P ＜O.05)，其他指標(biāo)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Open- Field 實(shí)驗(yàn)、tail -puspension 實(shí)驗(yàn)(s)

4.3 海馬S100β 蛋白表達(dá): 對(duì)照組S100β 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞胞體小，呈圓形或卵圓形，胞有突起，呈放射狀，散在分布，胞漿呈棕褐色(圖1)。模型組與對(duì)照組比較，海馬S100β陽(yáng)性細(xì)胞體積增大，染色較深(圖2)，S100β 免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)值(31.74 ±4.56)較對(duì)照組(26.13 ±4.52)顯著增高(P＜0.05)。藥物組與模型組比較，S100β 陽(yáng)性細(xì)胞體積縮小，染色變淺(圖3)，S100β 免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)值(27.03 ±5.41)較模型組(31.74 ±4.56)顯著減少(P＜0.05)。

大鼠海馬S100B 表達(dá)的平均灰度值比較，對(duì)照組138.8±9.1，模型組S100B 陽(yáng)性信號(hào)有所增強(qiáng)，灰度值為119.5±13.2，兩組比較有顯著差異(P＜0.01);藥物組灰度值為120.5 ±11.2，與模型組119.5 ±13.2 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 藥物組

圖1 -3 各組S100B 的表達(dá)(IHC×400)

圖1 對(duì)照組

圖2 模型組

5 討 論

腦內(nèi)生理量的S100β 主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，作用于神經(jīng)元及w 圍生長(zhǎng)環(huán)境，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、能量代謝和參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此，可視為星形膠質(zhì)細(xì)胞合成并分泌的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)元發(fā)育和損傷時(shí)維持其活力，對(duì)腦組織損傷起保護(hù)性作用［4］。正常情況下，腦內(nèi)S100β 蛋白少量表達(dá)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)水平上調(diào)，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，被認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記物之一，也被作為腦損傷的一種標(biāo)記物［5］。S100β 蛋白對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用依賴(lài)于濃度水平，低濃度神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，高濃度可引起神經(jīng)元變性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠慢性應(yīng)激5w 后抑郁程度增加，海馬S100β 陽(yáng)性細(xì)胞體積增大，染色變深，S100β 免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)值顯著增高，表明海馬作為情緒和行為調(diào)節(jié)的高級(jí)中樞，與應(yīng)激反應(yīng)、抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。發(fā)生的機(jī)制可能與CUMS 使膠質(zhì)細(xì)胞大量活化，干擾了神經(jīng)元之間、神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞間的正常聯(lián)系，致神經(jīng)元變性、細(xì)胞凋亡有關(guān)［7］;而膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)免疫細(xì)胞被激活，產(chǎn)生釋放許多細(xì)胞因子，引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化，影響抑郁大鼠的行為能力。

藥物組大鼠抑郁癥狀減輕，可能與蒙藥其察日嘎納使S100β 陽(yáng)性細(xì)胞體積縮小，染色變淺，S100β 免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)值顯著減少有關(guān)。而其作用的機(jī)制與其察日嘎納所含總黃酮及有效成分能直接清除氧自由基和羥自由基，降低血壓、降低血脂、降低血液粘稠度、抑制血小板聚集、軟化血管、改善腦供血供氧［8］;其察日嘎納所含的多種氨基酸，維生素、微量元素、不飽和脂肪酸(EPA、DHA)具有益智作用有關(guān)，其詳細(xì)作用機(jī)理有待深入研究。

［1］Zhang LM，Li YF，Gong ZH.Neurogenesis： a novel strategy for the treatment of depression［J］.Shengli Kexue Jinzhan，2005，36(2) ：109 -112.

［2］Kanner AA，Marchi N，F(xiàn)azio V，et al. Serum S100beta： A noninvasive marker of blood-brain barrier function and brain lesions［J］.Cancer，2003，97(11) ：2806 -2813.

［3］包新民，舒斯云. 大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.50.

［4］Zimmer DB，Cornwall EH，Landar A，et al. The S100 protein family： history，function，and express ion［J］. Brain Res Bull，1995，37(4) ：417-429.

［5］Michetti F，Gazzolo D. S100B protein in biological fluids：a tool for perinatal medicine［J］. Clin Chem，2002，48(12) ：2097-2104.

［6］Rothermundt M，Peters M，Prehn JH，et al. S100B in brain damageand neurodegeneration［J］. Microsc Res Tech，2003，60(6) ： 614 -32.

［7］Andersson M，Blomstrand F，Hanse E. Astrocytes play a critical role in transient heterosynaptic depression in the rat hippocampal CA1 region［J］.J Physiol，2007，585(3) ：843-852.

［8］張穎，張立木，李同德，等.泰山沙棘果對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的 保護(hù)作用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(6)464 -466.