張志宇+許珂+王靜+許鵬

【摘要】 目的：研究p53在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)及與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的關(guān)系。方法：對(duì)20例骨關(guān)節(jié)炎患者（OA組）及10例正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織（對(duì)照組），用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）、免疫組化等方法檢測(cè)p53及Beclin1在膝關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)與分布，并對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：p53在OA組的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），OA組關(guān)節(jié)軟骨組織中Beclin1的表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組（P<0.01），p53與Beclin1在軟骨組織中表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)（r=-0.629，P<0.05）。結(jié)論：骨關(guān)節(jié)炎中p53的高表達(dá)能夠抑制軟骨細(xì)胞自噬，從而減弱軟骨細(xì)胞對(duì)凋亡抵抗能力，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎； 自噬； p53； Beclin1

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)病，其主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的減少和軟骨基質(zhì)的降解，是致殘致畸的主要原因之一[1]。OA軟骨細(xì)胞的減少主要由于軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡引起，引起OA軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡的原因一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。隨著自噬現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其與凋亡關(guān)系研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬在OA軟骨細(xì)胞中減弱，從而促進(jìn)凋亡，但OA軟骨細(xì)胞自噬減弱的原因并不清楚[2]。最新研究認(rèn)為，抑癌基因p53是調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬的重要因子[3]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)p53及自噬調(diào)節(jié)因子Beclin1在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，探索OA軟骨細(xì)胞自噬減弱的原因，為OA的基礎(chǔ)及臨床研究提供新的方向及思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2012年11月-2013年4月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院住院預(yù)接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療患者中，根據(jù)根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）2008年修訂的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)病史、臨床檢查和X線平片等確診OA患者共20例作為OA組。其中男6例，女14例，平均年齡（71.3±8.9）歲。同時(shí)收集無(wú)關(guān)節(jié)疾病史及肉眼病變的因外傷截肢、交叉韌帶斷裂、半月板損傷等行手術(shù)治療的膝關(guān)節(jié)患者共10例作為對(duì)照組，其中男8例，女2例，平均年齡（42.4±6.7）歲，經(jīng)病理學(xué)診斷關(guān)節(jié)病變，作為正常對(duì)照組。受試者均知情同意參加本實(shí)驗(yàn)并經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組受試者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及方法

1.2.1 主要試劑 p53及Beclin1引物由南京金斯瑞公司合成，引物信息見(jiàn)表1；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司；SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ購(gòu)自日本Takara公司；p53及Beclin1多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司，即用SP免疫組化兩步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 方法 30例新鮮標(biāo)分為兩部分：一部分立即放入4%多聚甲醛中固定，10%EDTA脫鈣6、7周，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以4～5 μm厚度連續(xù)切片。行常規(guī)HE染色外，按試劑盒內(nèi)說(shuō)明分別行p53及Beclin1免疫組織化學(xué)染色，用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，經(jīng)染色后，陽(yáng)性信號(hào)呈黃褐色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×200），計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比；另一部分放入1‰DEPC水處理過(guò)的凍存管中浸液氮24 h后，轉(zhuǎn)移到-80 ℃凍存，Trizol法提取軟骨組織總RNA，經(jīng)微量核酸/蛋白定量?jī)x鑒定并定量后，根據(jù)Fermentas公司提供說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行熔解曲線分析，用于判定PCR反應(yīng)的特異性，是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶是否單一；內(nèi)參照為β-actin，基因表達(dá)量采用ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性及正態(tài)性檢驗(yàn)后，根據(jù)情況，兩組間均數(shù)的比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)；OA軟骨細(xì)胞中p53與Beclin1基因水平表達(dá)量用Pearson或Spearman檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 20例OA組與10例對(duì)照組的膝關(guān)節(jié)軟骨組織經(jīng)HE染色后比較軟骨組織的厚度、形態(tài)及軟骨細(xì)胞的數(shù)量可見(jiàn)：OA軟骨變薄、缺損，軟骨表面毛糙，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，呈簇狀生長(zhǎng)（見(jiàn)圖1A、B）。OA關(guān)節(jié)軟骨中p53陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于表層和中層，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有表達(dá)；對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨陽(yáng)性細(xì)胞分布部位與OA相似，但數(shù)量少，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1C、D、圖2。OA關(guān)節(jié)軟骨四層結(jié)構(gòu)中均可見(jiàn)到Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞分布，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨陽(yáng)性細(xì)胞分布部位與OA相似，但數(shù)量較多，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1E、F、圖2。

2.2 real time PCR結(jié)果 用realtime qPCR的方法檢測(cè)p53及Beclin1的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參照。結(jié)果顯示p53在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而Beclin1在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)圖3。

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果 OA患者20例關(guān)節(jié)軟骨組織中p53及Beclin1基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出r=-0.629（P<0.05），故認(rèn)為OA組織中p53及Beclin1基因的表達(dá)之間具有相關(guān)性，且呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖4。

3 討論

OA軟骨細(xì)胞的減少主要由于軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡引起[4]。Gobbi等[5]發(fā)現(xiàn)在OA膝關(guān)節(jié)軟骨的表層和中層有過(guò)度的細(xì)胞凋亡。應(yīng)用TUNEL法和熒光標(biāo)記的鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白V法檢測(cè)正常組和OA組的髖關(guān)節(jié)軟骨發(fā)現(xiàn)，在OA的關(guān)節(jié)軟骨中有18%～21%的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征，而只有2%～5%有凋亡特征的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)在正常組關(guān)節(jié)軟骨中[6]。

OA軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡與凋亡基因過(guò)度表達(dá)有關(guān)[7]。p53是重要的抑癌基因，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下調(diào)凋亡抑制基因如Bcl-2的表達(dá)[8]。細(xì)胞質(zhì)中的p53使 Bax誘導(dǎo)的MOMP增加[9]。NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解可以增加軟骨細(xì)胞中p53的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究也證實(shí)OA中p53無(wú)論在基因水平及蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，且主要分布在表層和中層，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與了OA軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。自噬通過(guò)降解蛋白及殘余細(xì)胞器為細(xì)胞節(jié)約并提供能量，清除某些有害的蛋白來(lái)防止或減少由這些聚集蛋白所引起的細(xì)胞毒性，中和細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[11]。Beclin1是重要的自噬調(diào)節(jié)基因，它與Vps34形成的復(fù)合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位，進(jìn)而介導(dǎo)自噬體的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ與Caspase3表達(dá)分布相反[13]。在OA患者的軟骨組織中研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加Beclin1介導(dǎo)的自吞噬途徑逐漸減弱，且與軟骨細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)[2]。自噬是保證關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞獲取ATP、中和應(yīng)激的重要手段，因此自噬被抑制使得軟骨細(xì)胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究發(fā)現(xiàn)，p53不僅可以促進(jìn)凋亡，也能調(diào)節(jié)自噬。腫瘤自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的p53可抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，因此當(dāng)物質(zhì)和能量缺乏時(shí)，雖然p53表達(dá)降低，但細(xì)胞為維持ATP水平自噬不僅沒(méi)有減弱反而增強(qiáng)[3]。本研究在OA軟骨細(xì)胞中也證實(shí)p53與Beclin1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明關(guān)節(jié)軟骨中p53可能抑制了Beclin1介導(dǎo)的自噬反應(yīng)，進(jìn)而使得OA軟骨細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。

綜上所述，由于OA中由于NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解等損傷因子增加，導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞p53表達(dá)增加，除了直接誘導(dǎo)凋亡外，還可使Beclin1介導(dǎo)的自噬水平降低，從而削弱自噬對(duì)軟骨細(xì)胞保護(hù)作用（如提供ATP、中和應(yīng)激反應(yīng)等），進(jìn)一步加劇OA軟骨細(xì)胞的凋亡。中止或者減弱這一過(guò)程，可能對(duì)減少OA細(xì)胞凋亡，甚至延緩OA軟骨退變的進(jìn)展，具有一定積極的意義。但OA軟骨細(xì)胞中p53抑制Beclin1的具體機(jī)制還須進(jìn)一步在細(xì)胞水平及分子水平進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

[1]許珂，許鵬.骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞死亡機(jī)制研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15（4）：271-274.

[2] Caramés B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2010，62（3）：791-801.

[3] Tasdemir E，Maiuri M C，Galluzzi L，et al.Regulation of autophagy by cytoplasmic p53[J].Nat Cell Biol，2008，10（6）：676-687.

[4] Abramson S B，Attur M.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2009，11（3）：227.

[5] Gobbi A，Kon E，Berruto M，et al.Patellofemoral full-thickness chondral defects treated with hyalograft-C：a clinical，arthroscopic，and histologic review[J].Am J Sports Med，2006，34（11）：1763-1773.

[6] Heraud F，Heraud A，Harmand M F.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J].Ann Rheum Dis，2000，59（12）：959-965.

[7] Kim J，Xu M，Xo R，et al.Mitochondrial DNA damage is involved in apoptosis caused by pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（3）：424-432.

[8] Follis A V，Chipuk J E，F(xiàn)isher J C，et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J].Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

[9] Montero J，Dutta C，van Bodegom D，et al.p53 regulates a non-apoptotic death induced by ROS[J].Cell Death Differ，2013，20（11）：1465-1474.

[10]Lundgreen K，Lian ?，Scott A，et al.Increased levels of apoptosis and p53 in partial-thickness supraspinatus tendon tears[J].Knee Surgery，Sports Traumatology，Arthroscopy，2013，21（7）：1636-1641.

[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

（收稿日期：2014-03-17） （本文編輯：歐麗）

OA軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡與凋亡基因過(guò)度表達(dá)有關(guān)[7]。p53是重要的抑癌基因，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下調(diào)凋亡抑制基因如Bcl-2的表達(dá)[8]。細(xì)胞質(zhì)中的p53使 Bax誘導(dǎo)的MOMP增加[9]。NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解可以增加軟骨細(xì)胞中p53的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究也證實(shí)OA中p53無(wú)論在基因水平及蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，且主要分布在表層和中層，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與了OA軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。自噬通過(guò)降解蛋白及殘余細(xì)胞器為細(xì)胞節(jié)約并提供能量，清除某些有害的蛋白來(lái)防止或減少由這些聚集蛋白所引起的細(xì)胞毒性，中和細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[11]。Beclin1是重要的自噬調(diào)節(jié)基因，它與Vps34形成的復(fù)合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位，進(jìn)而介導(dǎo)自噬體的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ與Caspase3表達(dá)分布相反[13]。在OA患者的軟骨組織中研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加Beclin1介導(dǎo)的自吞噬途徑逐漸減弱，且與軟骨細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)[2]。自噬是保證關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞獲取ATP、中和應(yīng)激的重要手段，因此自噬被抑制使得軟骨細(xì)胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究發(fā)現(xiàn)，p53不僅可以促進(jìn)凋亡，也能調(diào)節(jié)自噬。腫瘤自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的p53可抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，因此當(dāng)物質(zhì)和能量缺乏時(shí)，雖然p53表達(dá)降低，但細(xì)胞為維持ATP水平自噬不僅沒(méi)有減弱反而增強(qiáng)[3]。本研究在OA軟骨細(xì)胞中也證實(shí)p53與Beclin1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明關(guān)節(jié)軟骨中p53可能抑制了Beclin1介導(dǎo)的自噬反應(yīng)，進(jìn)而使得OA軟骨細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。

綜上所述，由于OA中由于NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解等損傷因子增加，導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞p53表達(dá)增加，除了直接誘導(dǎo)凋亡外，還可使Beclin1介導(dǎo)的自噬水平降低，從而削弱自噬對(duì)軟骨細(xì)胞保護(hù)作用（如提供ATP、中和應(yīng)激反應(yīng)等），進(jìn)一步加劇OA軟骨細(xì)胞的凋亡。中止或者減弱這一過(guò)程，可能對(duì)減少OA細(xì)胞凋亡，甚至延緩OA軟骨退變的進(jìn)展，具有一定積極的意義。但OA軟骨細(xì)胞中p53抑制Beclin1的具體機(jī)制還須進(jìn)一步在細(xì)胞水平及分子水平進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

[1]許珂，許鵬.骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞死亡機(jī)制研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15（4）：271-274.

[2] Caramés B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2010，62（3）：791-801.

[3] Tasdemir E，Maiuri M C，Galluzzi L，et al.Regulation of autophagy by cytoplasmic p53[J].Nat Cell Biol，2008，10（6）：676-687.

[4] Abramson S B，Attur M.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2009，11（3）：227.

[5] Gobbi A，Kon E，Berruto M，et al.Patellofemoral full-thickness chondral defects treated with hyalograft-C：a clinical，arthroscopic，and histologic review[J].Am J Sports Med，2006，34（11）：1763-1773.

[6] Heraud F，Heraud A，Harmand M F.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J].Ann Rheum Dis，2000，59（12）：959-965.

[7] Kim J，Xu M，Xo R，et al.Mitochondrial DNA damage is involved in apoptosis caused by pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（3）：424-432.

[8] Follis A V，Chipuk J E，F(xiàn)isher J C，et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J].Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

[9] Montero J，Dutta C，van Bodegom D，et al.p53 regulates a non-apoptotic death induced by ROS[J].Cell Death Differ，2013，20（11）：1465-1474.

[10]Lundgreen K，Lian ?，Scott A，et al.Increased levels of apoptosis and p53 in partial-thickness supraspinatus tendon tears[J].Knee Surgery，Sports Traumatology，Arthroscopy，2013，21（7）：1636-1641.

[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

（收稿日期：2014-03-17） （本文編輯：歐麗）

OA軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡與凋亡基因過(guò)度表達(dá)有關(guān)[7]。p53是重要的抑癌基因，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下調(diào)凋亡抑制基因如Bcl-2的表達(dá)[8]。細(xì)胞質(zhì)中的p53使 Bax誘導(dǎo)的MOMP增加[9]。NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解可以增加軟骨細(xì)胞中p53的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究也證實(shí)OA中p53無(wú)論在基因水平及蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，且主要分布在表層和中層，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與了OA軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。自噬通過(guò)降解蛋白及殘余細(xì)胞器為細(xì)胞節(jié)約并提供能量，清除某些有害的蛋白來(lái)防止或減少由這些聚集蛋白所引起的細(xì)胞毒性，中和細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[11]。Beclin1是重要的自噬調(diào)節(jié)基因，它與Vps34形成的復(fù)合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位，進(jìn)而介導(dǎo)自噬體的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ與Caspase3表達(dá)分布相反[13]。在OA患者的軟骨組織中研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加Beclin1介導(dǎo)的自吞噬途徑逐漸減弱，且與軟骨細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)[2]。自噬是保證關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞獲取ATP、中和應(yīng)激的重要手段，因此自噬被抑制使得軟骨細(xì)胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究發(fā)現(xiàn)，p53不僅可以促進(jìn)凋亡，也能調(diào)節(jié)自噬。腫瘤自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的p53可抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，因此當(dāng)物質(zhì)和能量缺乏時(shí)，雖然p53表達(dá)降低，但細(xì)胞為維持ATP水平自噬不僅沒(méi)有減弱反而增強(qiáng)[3]。本研究在OA軟骨細(xì)胞中也證實(shí)p53與Beclin1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明關(guān)節(jié)軟骨中p53可能抑制了Beclin1介導(dǎo)的自噬反應(yīng)，進(jìn)而使得OA軟骨細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。

綜上所述，由于OA中由于NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解等損傷因子增加，導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞p53表達(dá)增加，除了直接誘導(dǎo)凋亡外，還可使Beclin1介導(dǎo)的自噬水平降低，從而削弱自噬對(duì)軟骨細(xì)胞保護(hù)作用（如提供ATP、中和應(yīng)激反應(yīng)等），進(jìn)一步加劇OA軟骨細(xì)胞的凋亡。中止或者減弱這一過(guò)程，可能對(duì)減少OA細(xì)胞凋亡，甚至延緩OA軟骨退變的進(jìn)展，具有一定積極的意義。但OA軟骨細(xì)胞中p53抑制Beclin1的具體機(jī)制還須進(jìn)一步在細(xì)胞水平及分子水平進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

[1]許珂，許鵬.骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞死亡機(jī)制研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15（4）：271-274.

[2] Caramés B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2010，62（3）：791-801.

[3] Tasdemir E，Maiuri M C，Galluzzi L，et al.Regulation of autophagy by cytoplasmic p53[J].Nat Cell Biol，2008，10（6）：676-687.

[4] Abramson S B，Attur M.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2009，11（3）：227.

[5] Gobbi A，Kon E，Berruto M，et al.Patellofemoral full-thickness chondral defects treated with hyalograft-C：a clinical，arthroscopic，and histologic review[J].Am J Sports Med，2006，34（11）：1763-1773.

[6] Heraud F，Heraud A，Harmand M F.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J].Ann Rheum Dis，2000，59（12）：959-965.

[7] Kim J，Xu M，Xo R，et al.Mitochondrial DNA damage is involved in apoptosis caused by pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（3）：424-432.

[8] Follis A V，Chipuk J E，F(xiàn)isher J C，et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J].Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

[9] Montero J，Dutta C，van Bodegom D，et al.p53 regulates a non-apoptotic death induced by ROS[J].Cell Death Differ，2013，20（11）：1465-1474.

[10]Lundgreen K，Lian ?，Scott A，et al.Increased levels of apoptosis and p53 in partial-thickness supraspinatus tendon tears[J].Knee Surgery，Sports Traumatology，Arthroscopy，2013，21（7）：1636-1641.

[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

（收稿日期：2014-03-17） （本文編輯：歐麗）