劉祎 沙翔垠 彭娟 文曄 宋莉

翼狀胬肉是一種常見的球結(jié)膜纖維血管組織侵犯角膜的眼表疾病，目前廣泛認(rèn)可其發(fā)病與長(zhǎng)期暴露于紫外線有關(guān)[1]。近期通過細(xì)胞分子生物技術(shù)，證明了其機(jī)制涉及基因成分、抗凋亡機(jī)制、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫和病毒感染等[2]。翼狀胬肉的病理表現(xiàn)是纖維血管組織的增生[3]，其形成和發(fā)展都需要新生血管的參與，這說明生長(zhǎng)因子可能是翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展的直接或間接病因。有人提出翼狀胬肉發(fā)生的原因之一是由于血管生成刺激和抑制調(diào)節(jié)的失衡[4]。而VEGF又是最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子之一，這就使藥物能在分子水平抑制血管及細(xì)胞增殖，進(jìn)而成為抑制翼狀胬肉的生長(zhǎng)及復(fù)發(fā)的一個(gè)新的治療方向。Avastin 是重組人源化單克隆 IgG1抗體，它可與VEGF-A結(jié)合，阻斷VEGF-A與受體Flk-1、KDR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制人體內(nèi)外VEGF的生物活性。Avastin目前已被用于玻璃體內(nèi)注藥治療一些新生血管增生性疾病，例如年齡相關(guān)性黃斑病變、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變以及新生血管性青光眼，并且具有良好的耐受性及視力改善[5-6]，因此我們猜測(cè)，Avastin對(duì)翼狀胬肉的治療也具有安全性及臨床有效性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本收集選擇2012年6月至2013年6月在我院治療的原發(fā)翼狀胬肉患者50例，手術(shù)室無菌條件下取下的翼狀胬肉標(biāo)本，均位于鼻側(cè)，患者年齡24～65歲，平均年齡48.1；男性27例，女性23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)按照診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為原發(fā)性翼狀胬肉；(2)翼狀胬肉頭部侵入角膜2～5 mm；(3)患者同意手術(shù)治療并簽訂手術(shù)同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有眼部手術(shù)史；(2)有活動(dòng)性眼部炎癥性病變；(3)復(fù)發(fā)性、假性翼狀胬肉。

1.1.2試劑和儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗(Hyclone，美國(guó)Thermo公司)，胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，Avastin、LDH檢測(cè)試劑盒及WST-1試劑、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)，p-CyclinD1、t-CyclinD1、Caspase3抗體(美國(guó)CST公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分離無菌條件下將翼狀胬肉組織塊放入培養(yǎng)皿，PBS清洗3次，剪成1 mm×1 mm組織塊，將組織塊接種于6孔板，3～4 d可見有梭形細(xì)胞從組織塊周邊爬出，待長(zhǎng)滿后消化，接種于培養(yǎng)瓶，每2～3 d換液1次。

1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板(每孔100 μL，接種密度為20×103mL-1)，分為正常組(無處理)、Avastin組(2.50 g·L-1Avastin處理)。細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，然后更換體積分?jǐn)?shù)10%FBS培養(yǎng)基，加藥12 h、24 h、48 h、72 h，進(jìn)行WST-1實(shí)驗(yàn)，以光密度(OD值)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板(每孔100 μL，接種密度為20×103mL-1)，每板設(shè)空白對(duì)照組(無細(xì)胞)、細(xì)胞對(duì)照組(有細(xì)胞無處理)以及5個(gè)Avastin濃度組(0.25 g·L-1、0.50 g·L-1、1.00 g·L-1、1.50 g·L-1、2.50 g·L-1)，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，然后更換體積分?jǐn)?shù)10%FBS培養(yǎng)基，分別于加藥12 h、24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，避光2 h，振蕩10 s，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)]×100%。

1.2.4LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板(每孔100 μL，接種密度為 20×103mL-1)，每板設(shè)空白組、細(xì)胞對(duì)照組、樣品最大酶活性對(duì)照組以及5個(gè)Avastin濃度組(濃度同1.2.3)，每組濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，然后更換體積分?jǐn)?shù)1%FBS培養(yǎng)基，分別于12 h、24 h、48 h、72 h加藥，處理結(jié)束后根據(jù)試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率：細(xì)胞毒性或死亡率=(處理樣品OD值-樣品對(duì)照孔OD值) /(樣品最大酶活性組OD值-樣品對(duì)照孔OD值)×100 %。

1.2.5Westernblot方法檢測(cè)p-CyclinD1、t-CyclinD1、Caspase3的表達(dá)分為細(xì)胞對(duì)照組以及5個(gè)Avastin濃度組(濃度同1.2.3)，加藥72 h后，充分裂解細(xì)胞提取上清蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每孔上樣20 μg蛋白總量，電泳后轉(zhuǎn)至20 μm孔徑的PVDF膜，BSA封閉30 min后，4 ℃孵育一抗14 h，然后常溫孵育二抗1 h，顯影劑曝光條帶。

2 結(jié)果

2.1翼狀胬肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖1可見，加藥后12 h和24 h時(shí)，2.50 g·L-1Avastin組與正常組相比光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.172、P=0.153)；48 h及72 h Avastin組曲線則上升緩慢，與正常組相比光密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034、P=0.016)。

2.2對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用Avastin隨藥物濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用增強(qiáng)，尤其當(dāng)濃度>1.00 g·L-1，時(shí)間>24 h時(shí)，抑制作用明顯增強(qiáng)(表1)。與12 h相比，0.25 g·L-1Avastin組及0.50 g·L-1Avastin組作用24 h、48 h、72 h后細(xì)胞增殖抑制率無明顯提高(均為P>0.05)，1.50 g·L-1Avastin組及2.50 g·L-1Avastin組作用48 h、72 h后細(xì)胞增殖抑制率均明顯提高(均為P<0.05)。與0.25 g·L-1Avastin組相比，0.50 g·L-1Avastin組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(除12 h外)細(xì)胞增殖抑制率均無明顯提高(均為P>0.05)，1.50 g·L-1Avastin組、2.50 g·L-1Avastin組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)抑制率均明顯提高(均為P<0.05)。

Figure 1 Growth curve of HPF of two groups 正常組以及Avastin組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

表1 貝伐單抗對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制率

2.3Avastin對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性

圖2示各濃度Avastin組在 12 h、24 h、48 h、72 h對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞LDH釋放較最大釋放組(加入裂解酶)均小于20%甚至為負(fù)值，因此評(píng)價(jià)Avastin呈低細(xì)胞毒性或無細(xì)胞毒性。Avastin各濃度組與LDH最大釋放組對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞LDH釋放率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，同時(shí)間點(diǎn)Avastin各濃度組間、不同時(shí)間點(diǎn)同一濃度Avastin組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

Figure 2 Cytotoxicity of Avastin on HPF Avastin對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.4Avastin對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響由圖3可見，隨著Avastin濃度的增高，與細(xì)胞對(duì)照組相比，p-CyclinD1蛋白表達(dá)均下降(均為P<0.05)，呈濃度依賴性；但t-CyclinD1的表達(dá)沒有明顯變化(均為P>0.05)，Caspase3的表達(dá)升高(均為P<0.05)，但未觀察到明顯濃度效應(yīng)。

Figure 3 Expression of p-cyclinD1,total-cyclinD1 and Caspase 3 detected by Western blot (Compared with control,*P<0.05) Western blot檢測(cè)蛋白p-CyclinD1、t-CyclinD1、Caspase3的表達(dá)(與細(xì)胞對(duì)照組相比，*P<0.05)

3 討論

既往認(rèn)為VEGF主要是通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞從而抑制新生血管生長(zhǎng)而發(fā)揮抗增殖作用，但是現(xiàn)研究表明VEGF及其受體除了在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)外，多種眼組織細(xì)胞如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等也存在VEGF的自分泌以及其受體的表達(dá)[2，7-8]，提示在翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制中可能存在自分泌以及旁分泌的協(xié)同作用，因此阻斷VEGF的信號(hào)通路可以多方面抑制眼表新生血管性疾病的進(jìn)展。

翼狀胬肉是眼科最常見影響視力的眼表增生性疾病，流行病學(xué)資料表明亞洲翼狀胬肉患病率相當(dāng)高[9]，我國(guó)成人10 a發(fā)病率為4.9%[10]，尤其在超過50歲人群中，發(fā)病率是33.0%[9]，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面。目前，臨床上對(duì)翼狀胬肉的治療以手術(shù)切除為主，早期只做頭部的簡(jiǎn)單切除，后來有學(xué)者提出暴露鞏膜法可阻斷殘留組織的再生，然而，其術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50.0%[11]，通過手術(shù)的改良、結(jié)膜瓣的轉(zhuǎn)位、角膜緣干細(xì)胞移植、羊膜移植手術(shù)，可明顯降低術(shù)后的復(fù)發(fā)，但仍有一定的復(fù)發(fā)率。因此解決胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)是治療該病的關(guān)鍵。

目前已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，貝伐單抗局部球結(jié)膜注射或滴眼治療能夠有效抑制角膜新生血管，并且對(duì)角膜上皮愈合無明顯影響[12-13]。Mauro等[14]對(duì)初發(fā)以及復(fù)發(fā)的翼狀胬肉患者結(jié)膜下注射Avastin 12周后觀察到胬肉面積明顯減小，并且未觀察到與治療相關(guān)的毒副作用。Ozgurhan 等[15]對(duì)術(shù)后胬肉復(fù)發(fā)2次患者的研究也顯示Avastin局部滴眼可以有效減少新生血管形成，并且患者耐受性好。這些都證明了Avastin在治療眼表新生血管性疾病方面有著良好的前景。在對(duì)眼表疾病和翼狀胬肉的治療中，局部球結(jié)膜注射或滴眼治療就足以使藥物到達(dá)病變部位，發(fā)揮療效，避免了全身用藥以及眼內(nèi)注射的并發(fā)癥發(fā)生。

本研究采用WST-1法測(cè)定Avastin對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)Avastin能夠直接抑制翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度為2.50 g·L-1時(shí)作用72 h抑制率為30.10%±1.11%，對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞具有明顯的抑制作用。其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，可能與阻滯細(xì)胞周期、加速細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。然后進(jìn)一步通過對(duì)細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性檢測(cè)揭示Avastin是否具有細(xì)胞毒性，Avastin呈低毒性或無毒性，部分低毒性結(jié)果可能與細(xì)胞自身代謝產(chǎn)生的LDH有關(guān)，故可推測(cè)Avastin對(duì)翼狀胬肉成纖維無明顯細(xì)胞毒性。Deissler等[16]證明Avastin和Lucentis對(duì)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性，Philipp等[8]證明Avastin對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞、脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞均無細(xì)胞毒性，均證實(shí)Avastin的安全性。

本實(shí)驗(yàn)還通過Western blot法檢測(cè)Avastin刺激后的細(xì)胞中p-CyclinD1、t-CyclinD1以及Caspase 3的表達(dá)，結(jié)果顯示，Avastin可以濃度依賴性抑制p-CyclinD1的活化，但不引起t-CyclinD1蛋白的減少，并且引起Caspase3蛋白表達(dá)升高，故Avastin可以抑制細(xì)胞分裂，并增加細(xì)胞凋亡。CyclinD1是一種細(xì)胞周期蛋白，當(dāng)生長(zhǎng)因子如VEGF、bFGF等存在的條件下，可激活其與CDK4結(jié)合，形成CyclinD1/CDK4復(fù)合物，促進(jìn)pRb的磷酸化并釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增生。在正常細(xì)胞中CyclinD1參與細(xì)胞G1期，使細(xì)胞周期從G1期過渡到S期，當(dāng)生長(zhǎng)因子缺乏時(shí)，CyclinD1活化減少，G1期的細(xì)胞則會(huì)進(jìn)入G0期(靜止期)。Caspase3是參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的一種凋亡蛋白，在細(xì)胞程序性死亡中起著至關(guān)重要的作用。

綜上所述，Avastin對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞有顯著的抑制增殖作用以及促凋亡作用，同樣可以發(fā)現(xiàn)VEGF對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)起著重要的作用。因此，可為預(yù)防和治療翼狀胬肉提供新的理論依據(jù)，但還需進(jìn)一步研究確認(rèn)其對(duì)其他細(xì)胞信號(hào)通路、其他眼表細(xì)胞的作用，以及在眼部代謝的半衰期等，以確定有效的治療濃度及最佳給藥途徑。

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