梁娟+于盟盟+韓梅+魏海英+孟霞

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.04.019

硝基呋喃類抗菌劑（Nitrofurans）是一種廣效性抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲均有作用，因其價(jià)格低廉且對(duì)動(dòng)物性傳染病的預(yù)防與治療具有良好的效果而曾經(jīng)在養(yǎng)殖業(yè)中較為廣泛應(yīng)用。但是，經(jīng)研究證明，含有硝基呋喃類抗菌劑及其代謝物的食物被人類長期食用后，有致癌、致畸胎等健康危害，因此已被大多數(shù)國家明令禁止在人類可食用的動(dòng)物源性食品中使用。

硝基呋喃類抗菌劑原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速，無法檢測；而其代謝物呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃咜酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）和呋喃妥因（Nitrofurantoin）能與組織蛋白質(zhì)緊密結(jié)合而相當(dāng)穩(wěn)定，故利用其代謝物的檢測可反映硝基呋喃類抗菌劑的殘留狀況。

目前，動(dòng)物體內(nèi)硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜—質(zhì)譜法和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法，上述方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，常作為藥物殘留檢測的確認(rèn)方法。然而此類方法對(duì)儀器和操作人員要求都較高；每個(gè)樣品檢測費(fèi)用大；前處理過程均需過夜衍生，耗時(shí)較長，不能滿足現(xiàn)場抽檢的需求和推廣應(yīng)用。ELISA技術(shù)與上述儀器分析方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是樣本前處理過程相對(duì)簡單，對(duì)儀器和人員要求不是很高，檢測人員經(jīng)過短期培訓(xùn)即可上崗；二是樣品整個(gè)檢測過程中所用試劑多數(shù)為無機(jī)試劑，與有機(jī)試劑相比，對(duì)人體傷害和環(huán)境污染威脅小，檢測人員無需特殊防護(hù)用具；三是該方法耗時(shí)短，檢測過程只需要不到1 h，適于現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查；四是檢出限低，靈敏度高，可達(dá)到μg/kg或ng/kg水平，符合藥物殘留檢測分析的要求。

基于以上特點(diǎn)，ELISA法已成為目前藥品殘留檢測的有效檢測方法之一。

近幾年來，本中心利用ELISA法承擔(dān)上級(jí)漁業(yè)主管部門下達(dá)的水產(chǎn)品國家違禁藥物殘留的篩查任務(wù)，篩選出的陽性樣品，分別經(jīng)山東省水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心和中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃河水產(chǎn)研究所用大型儀器分析方法確證，準(zhǔn)確率為100%。在圓滿完成上級(jí)漁業(yè)主管部門下達(dá)的篩選任務(wù)的同時(shí)，本中心取得了一定的操作經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)小結(jié)，與大家共勉。

1 加標(biāo)回收

樣品在萃取、轉(zhuǎn)移及凈化處理等過程中，會(huì)有基體干擾或待檢成分的損失情況。因此，加標(biāo)回收率的測定是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)常用以自控的一種質(zhì)量控制技術(shù)，以驗(yàn)證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1.1 樣品空白的選取

樣品空白是指在檢測程序中，使用某個(gè)濃度的樣品作為儀器的零基準(zhǔn)。樣品空白可以抵消加入測試試劑前由于樣品自身含有待測成分引起的正誤差。空白樣品的選擇對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

加標(biāo)回收分空白加標(biāo)回收和樣品加標(biāo)回收兩種，幾年來，本中心針對(duì)這兩種加標(biāo)回收做了大量的驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品加標(biāo)回收，如果待測樣品背景值較高，所得回收率會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。本中心利用同一樣品對(duì)呋喃西林和呋喃咜酮兩個(gè)項(xiàng)目同時(shí)做加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果得知，該樣品中呋喃咜酮背景值很低，兩個(gè)添加濃度的加標(biāo)回收率均在80%～110%之間；而呋喃西林項(xiàng)目由于背景值較高，兩個(gè)添加濃度的回收率分別為207和81.7，出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

本中心還請(qǐng)教了省級(jí)水產(chǎn)品檢測中心等權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)經(jīng)驗(yàn)豐富的專家，得出的結(jié)論與本中心所做驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果一致。所以本中心一般選擇空白加標(biāo)回收，所得結(jié)果準(zhǔn)確率為100%。

表1 同一樣品不同項(xiàng)目的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)

項(xiàng)目 試樣測定值

/μg?kg-1 加標(biāo)濃度

/μg?kg-1 加標(biāo)試樣測定

值/μg?kg-1 加標(biāo)回

收率/%

呋喃咜酮 0.082 0.5 0.548 93.2

1.0 0.974 89.2

呋喃西林 0.242 0.5 1.281 207

1.0 1.059 81.7

1.2 加標(biāo)試驗(yàn)應(yīng)遵循的幾條原則

1.2.1 一致原則 樣品與加標(biāo)試樣按相同的操作步驟和方法同時(shí)測定，保證試驗(yàn)條件一致。為保證準(zhǔn)確度，樣品和加標(biāo)樣分別進(jìn)行平行測試，以平均值帶入計(jì)算。

1.2.2 可比原則 加標(biāo)樣中原始樣品的取樣量、稀釋倍數(shù)及測試體積，盡可能與測試樣品一致。

一般文獻(xiàn)上要求加標(biāo)量不宜過大，一般為待測成分含量的0.5～2.0倍，且加標(biāo)后的總含量不應(yīng)超過方法的測定上限。要想做到這一點(diǎn)，需要檢測人員正確估量樣品中待測成分的含量，這對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不是很豐富的檢測人員來說難度有點(diǎn)大。本中心一般選取標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的中間濃度做加標(biāo)濃度。

1.2.3 不變?cè)瓌t 加標(biāo)物的濃度宜高，加標(biāo)體積宜小，一般不超過原始試樣體積的1%，保持樣品的基體不變。

1.2.4 適用原則 容易實(shí)施，便于回收率的計(jì)算。

加標(biāo)回收率=

（加標(biāo)式樣測定值-式樣測定值）加標(biāo)濃度×100%

2 加標(biāo)回收率的意義

加標(biāo)回收除了考察待測樣品前處理及上機(jī)測試全過程中所測成分的破壞或損失情況，更重要的一點(diǎn)，對(duì)于國家食品安全有殘留限量的藥物殘留，需要用加標(biāo)回收率折算檢測結(jié)果，以防止不合格樣品流向市場，給廣大消費(fèi)者造成傷害。例如，某種獸藥的限量值為1.0 μg/kg，如果某個(gè)樣品的檢測結(jié)果為0.9 μg/kg，在不做加標(biāo)回收的情況下可以判定該產(chǎn)品合格。但是，如果做了加標(biāo)回收，加標(biāo)回收率為80%，通過檢測結(jié)果和回收率折算，該產(chǎn)品的獸藥濃度為1.1 μg/kg，該產(chǎn)品應(yīng)被判定為不合格。

3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析利用

目前市面上ELISA試劑盒的價(jià)格普遍較高，一般96孔的試劑盒的價(jià)格在四五千元左右。進(jìn)行樣品檢測時(shí)，一般要求標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上才可以對(duì)樣品中待測成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量，但有時(shí)候難免出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)做的比較低的情況。為了節(jié)約試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，我們一般通過對(duì)相關(guān)系數(shù)比較低的曲線各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行分析。如果一條曲線相關(guān)系數(shù)的偏離只是因?yàn)闃O個(gè)別的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，其他的幾個(gè)點(diǎn)的線性關(guān)系良好，那么，只要是位于這幾個(gè)點(diǎn)濃度范圍內(nèi)的所檢樣品的檢測值是可信的。

4 ELISA方法操作過程中注意事項(xiàng)

4.1 樣品前處理

提取試劑的添加要準(zhǔn)確，渦旋混勻的時(shí)間要嚴(yán)格按照說明書操作，時(shí)間過長，容易造成乳化現(xiàn)象和溶解出更多的雜質(zhì)成分；時(shí)間過短，容易造成混合不均勻、提取不充分，造成假陰性。離心轉(zhuǎn)速或離心力應(yīng)達(dá)到說明書要求，樣品氮吹時(shí)，應(yīng)盡量吹干，不要?dú)埩粲袡C(jī)溶劑。去除上層正己烷等脂肪層時(shí)，應(yīng)確保去除干凈，防止對(duì)結(jié)果造成干擾影響。

4.2 試劑盒保存

試劑盒應(yīng)當(dāng)在2～8 ℃的溫度下儲(chǔ)存（試劑盒說明書有特殊規(guī)定的，嚴(yán)格按照規(guī)定的儲(chǔ)存條件執(zhí)行），不能在過熱或過冷的溫度下放置時(shí)間太長。

微孔板應(yīng)盡量真空、干燥保存以保持更好的穩(wěn)定性，因此剩余的微孔板要盡快放回密封袋保存；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

4.3 試劑盒平衡

每個(gè)試劑盒都有相應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度，用前一般需在室溫放置20～30 min以上。試劑及樣本沒有回復(fù)至室溫20～25 ℃，將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20 min。如果試劑體積較大則需要回溫時(shí)間較長，不能用溫水浴回溫。

4.4 保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)力求與標(biāo)準(zhǔn)品同步檢測；

加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液以及各種試劑時(shí)，為確保時(shí)間的一致性，應(yīng)使用定量多道加液器，且加液過程要迅速完成；

定量多道加液器應(yīng)定期校準(zhǔn)，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)；

一個(gè)人操作時(shí)，一個(gè)項(xiàng)目一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。

4.5 避免板內(nèi)差異性大應(yīng)注意的問題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時(shí)推到二檔，出液時(shí)推到一檔；

加液后若出現(xiàn)氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過程中若有液體濺出，不但對(duì)鄰近孔造成污染，而且會(huì)流到板底，影響吸光度，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；

加樣應(yīng)盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準(zhǔn)確性。

4.6 試劑盒操作的環(huán)境條件

確保在標(biāo)準(zhǔn)室溫20～25 ℃下操作，避免在空調(diào)風(fēng)口或者窗口進(jìn)行操作，溫度過低，會(huì)出現(xiàn)吸光度值偏低的現(xiàn)象；如果在陽光直射下試驗(yàn)，不但會(huì)因?yàn)檫^熱造成試劑蒸發(fā)，而且會(huì)造成吸光度值偏高等導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果失準(zhǔn)的現(xiàn)象。如果操作臺(tái)溫度過低，應(yīng)鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測定中影響測定成敗的關(guān)鍵因素之一；

孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，以免出現(xiàn)吸光度值偏高或偏低的現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；

孵育過程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達(dá)到孵育要求；

如果樣品量少，一次測定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，以提高測定的重復(fù)性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數(shù)以及每次每孔洗液的加入量要規(guī)范，以免因洗滌不當(dāng)而造成吸光度值過高的現(xiàn)象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準(zhǔn)確性；

最后一次洗滌后進(jìn)行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果；

板孔干燥時(shí)間過長，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)低、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測定中，若出現(xiàn)0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時(shí)，即使標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到要求亦不能采用。為了避免出現(xiàn)這種情況，在定量測定中，顯色時(shí)間一般根據(jù)試劑盒說明書控制。也可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在顯色較深時(shí)，適當(dāng)提前2～3 min終止反應(yīng)；在顯色較淺時(shí)，適當(dāng)延長2～3 min顯色反應(yīng)時(shí)間。

4.11 假陽性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

見表2。

表2 假陽性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

問題 原因 解決方法

假陽性

假陰性 水質(zhì)原因

試驗(yàn)操作

原因

實(shí)驗(yàn)儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證 應(yīng)確保純水

現(xiàn)制現(xiàn)用

離心不徹底 延長離心時(shí)間或

改變轉(zhuǎn)速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準(zhǔn)確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機(jī)試劑干擾 更換試劑

有機(jī)試劑變質(zhì) 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會(huì)影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步驟之中，本文特對(duì)常見問題及原因歸納總結(jié)，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）

4.4 保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)力求與標(biāo)準(zhǔn)品同步檢測；

加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液以及各種試劑時(shí)，為確保時(shí)間的一致性，應(yīng)使用定量多道加液器，且加液過程要迅速完成；

定量多道加液器應(yīng)定期校準(zhǔn)，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)；

一個(gè)人操作時(shí)，一個(gè)項(xiàng)目一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。

4.5 避免板內(nèi)差異性大應(yīng)注意的問題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時(shí)推到二檔，出液時(shí)推到一檔；

加液后若出現(xiàn)氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過程中若有液體濺出，不但對(duì)鄰近孔造成污染，而且會(huì)流到板底，影響吸光度，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；

加樣應(yīng)盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準(zhǔn)確性。

4.6 試劑盒操作的環(huán)境條件

確保在標(biāo)準(zhǔn)室溫20～25 ℃下操作，避免在空調(diào)風(fēng)口或者窗口進(jìn)行操作，溫度過低，會(huì)出現(xiàn)吸光度值偏低的現(xiàn)象；如果在陽光直射下試驗(yàn)，不但會(huì)因?yàn)檫^熱造成試劑蒸發(fā)，而且會(huì)造成吸光度值偏高等導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果失準(zhǔn)的現(xiàn)象。如果操作臺(tái)溫度過低，應(yīng)鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測定中影響測定成敗的關(guān)鍵因素之一；

孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，以免出現(xiàn)吸光度值偏高或偏低的現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；

孵育過程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達(dá)到孵育要求；

如果樣品量少，一次測定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，以提高測定的重復(fù)性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數(shù)以及每次每孔洗液的加入量要規(guī)范，以免因洗滌不當(dāng)而造成吸光度值過高的現(xiàn)象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準(zhǔn)確性；

最后一次洗滌后進(jìn)行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果；

板孔干燥時(shí)間過長，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)低、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測定中，若出現(xiàn)0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時(shí)，即使標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到要求亦不能采用。為了避免出現(xiàn)這種情況，在定量測定中，顯色時(shí)間一般根據(jù)試劑盒說明書控制。也可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在顯色較深時(shí)，適當(dāng)提前2～3 min終止反應(yīng)；在顯色較淺時(shí)，適當(dāng)延長2～3 min顯色反應(yīng)時(shí)間。

4.11 假陽性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

見表2。

表2 假陽性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

問題 原因 解決方法

假陽性

假陰性 水質(zhì)原因

試驗(yàn)操作

原因

實(shí)驗(yàn)儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證 應(yīng)確保純水

現(xiàn)制現(xiàn)用

離心不徹底 延長離心時(shí)間或

改變轉(zhuǎn)速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準(zhǔn)確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機(jī)試劑干擾 更換試劑

有機(jī)試劑變質(zhì) 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會(huì)影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步驟之中，本文特對(duì)常見問題及原因歸納總結(jié)，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）

4.4 保證標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)力求與標(biāo)準(zhǔn)品同步檢測；

加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液以及各種試劑時(shí)，為確保時(shí)間的一致性，應(yīng)使用定量多道加液器，且加液過程要迅速完成；

定量多道加液器應(yīng)定期校準(zhǔn)，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)；

一個(gè)人操作時(shí)，一個(gè)項(xiàng)目一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。

4.5 避免板內(nèi)差異性大應(yīng)注意的問題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時(shí)推到二檔，出液時(shí)推到一檔；

加液后若出現(xiàn)氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過程中若有液體濺出，不但對(duì)鄰近孔造成污染，而且會(huì)流到板底，影響吸光度，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；

加樣應(yīng)盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準(zhǔn)確性。

4.6 試劑盒操作的環(huán)境條件

確保在標(biāo)準(zhǔn)室溫20～25 ℃下操作，避免在空調(diào)風(fēng)口或者窗口進(jìn)行操作，溫度過低，會(huì)出現(xiàn)吸光度值偏低的現(xiàn)象；如果在陽光直射下試驗(yàn)，不但會(huì)因?yàn)檫^熱造成試劑蒸發(fā)，而且會(huì)造成吸光度值偏高等導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果失準(zhǔn)的現(xiàn)象。如果操作臺(tái)溫度過低，應(yīng)鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測定中影響測定成敗的關(guān)鍵因素之一；

孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，以免出現(xiàn)吸光度值偏高或偏低的現(xiàn)象，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；

孵育過程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達(dá)到孵育要求；

如果樣品量少，一次測定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，以提高測定的重復(fù)性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數(shù)以及每次每孔洗液的加入量要規(guī)范，以免因洗滌不當(dāng)而造成吸光度值過高的現(xiàn)象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準(zhǔn)確性；

最后一次洗滌后進(jìn)行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果；

板孔干燥時(shí)間過長，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)低、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測定中，若出現(xiàn)0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時(shí)，即使標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到要求亦不能采用。為了避免出現(xiàn)這種情況，在定量測定中，顯色時(shí)間一般根據(jù)試劑盒說明書控制。也可依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在顯色較深時(shí)，適當(dāng)提前2～3 min終止反應(yīng)；在顯色較淺時(shí)，適當(dāng)延長2～3 min顯色反應(yīng)時(shí)間。

4.11 假陽性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

見表2。

表2 假陽性與假陰性的產(chǎn)生原因及處理方法

問題 原因 解決方法

假陽性

假陰性 水質(zhì)原因

試驗(yàn)操作

原因

實(shí)驗(yàn)儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證 應(yīng)確保純水

現(xiàn)制現(xiàn)用

離心不徹底 延長離心時(shí)間或

改變轉(zhuǎn)速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準(zhǔn)確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機(jī)試劑干擾 更換試劑

有機(jī)試劑變質(zhì) 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會(huì)影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步驟之中，本文特對(duì)常見問題及原因歸納總結(jié)，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）