陳永平+張素青+李連慶+李春青+馬丹+高麗娜+張萍

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.008

摘 要：改進(jìn)了水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物測(cè)定-超高效液相色譜法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、流動(dòng)相稀釋后進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)分析。色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3( 1.8 μm，2.1×100 mm) 色譜柱，流動(dòng)相為甲醇與0.2%甲酸水，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍270 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為4 μL，磺胺類(lèi)藥物在0.01～0.5 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可以準(zhǔn)確地判斷水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物，并進(jìn)行定量計(jì)算。

關(guān)鍵詞：磺胺類(lèi)藥物；超高效液相色譜；水產(chǎn)品

磺胺類(lèi)藥物是常用的廣譜抗菌藥[1]。因其具有抗菌譜廣、高效、低毒和價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在動(dòng)物養(yǎng)殖中被廣泛使用。人類(lèi)經(jīng)常食用有磺胺類(lèi)藥物殘留的動(dòng)物源性食品，可能引起磺胺類(lèi)藥物在體內(nèi)的逐漸累積。其危害性主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性、過(guò)敏、造血紊亂、致癌作用等[2-3]。目前中國(guó)、歐盟、美國(guó)、日本等均將磺胺類(lèi)藥物列為動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中限制使用的藥物，最大殘留限量一般為50～100 μg/kg。測(cè)定動(dòng)物組織中磺胺類(lèi)藥物的分析方法較多，包括毛細(xì)管電泳法，液相色譜法，氣相色譜法，液相色譜-質(zhì)譜法等[4-9]，應(yīng)用最廣泛的主要為液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜法。有些方法前處理復(fù)雜，上機(jī)分析時(shí)間較長(zhǎng)或成本較高影響了實(shí)驗(yàn)效率。本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相、前處理提取試劑，建立的方法具有提取簡(jiǎn)單、凈化速度快、實(shí)驗(yàn)周期短、回收率高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足檢測(cè)需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備Waters UPLC 超高效液相色譜，二極管陣列檢測(cè)器，Empower2 色譜工作站（購(gòu)自Waters科技有限公司）；MILIPORE超純水器；METTLER XP205 電子天平（梅特勒-托利多公司，0.001 g），旋渦混合器（上海康華儀器制造廠），均質(zhì)器（飛利浦公司，轉(zhuǎn)速10 000 r/min），離心機(jī)(Sigma公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

乙酸乙酯(TEDIA)、甲醇(TEDIA)、正己烷(TEDIA)、異丙醇(TEDIA)均為色譜純，甲酸(優(yōu)級(jí)純)，超純水。

磺胺標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺多辛、磺胺異噁唑、磺胺喹噁啉，純度均不小于98.0%。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取各磺胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇分別溶解并定容至10 mL，各磺胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1 000 mg/L。避光4 ℃冷藏保存，保存期為1個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：適量移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋并定容至10 mL，在室溫下混勻。其中磺胺嘧啶10 mg/L、磺胺噻唑10 mg/L、磺胺甲基嘧啶10 mg/L、磺胺二甲基嘧啶10 mg/L、磺胺甲基異噁唑20 mg/L、磺胺多辛20 mg/L、磺胺異噁唑20 mg/L、磺胺喹噁啉20 mg/L。避光4 ℃冷藏保存，保存期為1周。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1.25 mL，用流動(dòng)相稀釋并定容至100 mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 魚(yú)，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蝦，去頭、去殼、去腸線，取肌肉部分；樣品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后混合。

1.2.2 提取 將樣品解凍，稱取5.00 g，置于50 mL玻璃離心管。然后加入25 mL乙酸乙酯，超聲1 min，均質(zhì)機(jī)14 000 r/min均質(zhì)1 min，漩渦混勻1 min，9 000 r/min離心5 min，將乙酸乙酯過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱到100 mL梨形瓶中。再向原離心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋渦混勻1 min，9 000 r/min離心5 min，將乙酸乙酯層過(guò)無(wú)水硫酸鈉合并于100 mL梨形瓶中，清洗液合并于梨形瓶中于40 ℃水浴中減壓濃縮至近干，先加入1 mL流動(dòng)相，再加入2 mL正己烷，渦旋1 min，轉(zhuǎn)移至離心管中4 000 r/min離心3 min，棄正己烷，底層過(guò)0.25 μm濾膜，待上機(jī)。

1.2.3 色譜條件ACQUITY UPLC HSS T3 ( 1.8 μm，2.1×100 mm) 色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為4 μL；流動(dòng)相A 相:0.2%甲酸水溶液，B 相: 甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

時(shí)間/min 流速/mL?min-1 A% B%

初始 0.4 80 20

0.500.4 80 20

3.200.4 70 30

5.500.4 30 70

6.000.4 80 20

7.000.4 80 20

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)分別采用乙腈與乙酸銨溶液、甲醇與乙酸銨溶液、甲醇與0.1%甲酸水、甲醇與0.2%甲酸水作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇與0.2%甲酸水流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫，各組分色譜峰型、響應(yīng)值與分離度最好。實(shí)驗(yàn)選擇甲醇與0.2%甲酸水作為流動(dòng)相，梯度洗脫，7 min即可完成分析。

2.2 樣品提取條件的選擇

試驗(yàn)分別采用乙腈-氯仿（10∶1）、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈作為提取劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用乙酸乙酯作為提取劑各組分回收率均在80%～120%之間，回收效果明顯好于其他提取劑，雜質(zhì)干擾小，各組分分離度好。所以本方法選擇乙酸乙酯作為提取劑。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

圖1 8種磺胺標(biāo)準(zhǔn)圖

圖2 魚(yú)樣空白色譜圖

圖3 魚(yú)肉樣品添加色譜圖

0.2%甲酸水-甲醇( 80: 20) 將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成外標(biāo)濃度為10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析，以外標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制得8種磺胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，其相關(guān)系數(shù)在0.998 0～0.999 9 之間。方法檢出限( LOD) 以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N＝3 計(jì)算得出10.0 μg/kg。定量限( LOQ) 是以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N＝10 計(jì)算得出25 μg/kg。

2.4 添加回收率驗(yàn)證

取空白魚(yú)樣品分別向其中加入50 μg/kg、100 μg/kg 和200 μg/kg 濃度的磺胺類(lèi)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)行提取、凈化及色譜分析。每個(gè)添加水平作5 份平行測(cè)定，結(jié)果表明: 平均回收率為78.5%～95.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～10.3%，結(jié)果見(jiàn)表2。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用超高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物，靈敏度高，檢測(cè)限低，線性、回收率均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 試樣加標(biāo)回收率和重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

添加濃度/

μg?kg-1 測(cè)定參數(shù)/% 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺甲

基嘧啶 磺胺二甲

基嘧啶 磺胺甲基

異噁唑 磺胺

多辛 磺胺

異噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

參考文獻(xiàn)：

[1] 白麗麗，戴華，林正峰.高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蝦中9 種磺胺類(lèi)藥物的殘留[J].藥品鑒定，2011,18（23）:60-62

[2] 段振娟,張鴻雁,王碩.動(dòng)物性食品中磺胺類(lèi)藥物殘留分析研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2007,28(6):149-152

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[4] 游輝,于輝,武顏文,等.快速溶劑萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牛肉中5 種磺胺類(lèi)藥物殘留[J].化學(xué)通報(bào),2010,73(9):854-857

[5] 劉正才,楊方,余孔捷,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素族抗生素藥物殘留[J].食品科學(xué),2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,張傳港,宗素艷,等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定磺胺類(lèi)藥物的離解常數(shù)及其制劑的含量[J].藥物分析雜志,2008,28(2):243～246

[7] 黃德鳳,戚雋淵,孫建華,等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中19種磺胺類(lèi)藥物殘留量[J].水產(chǎn)科技情報(bào),2012,40(3):148-151

[8] 吳淑秀，公茂金，朱萬(wàn)燕,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉和豬肝中9種磺胺類(lèi)藥物的殘留[J].分析試驗(yàn)室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏慶，王穎，張丹,等.高效液相色譜—紫外法對(duì)13種磺胺類(lèi)藥物的同步檢測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)2012, 39（4）:233-237

Improvement of determination of sulfa drugs residues in

aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

(Super ision and test Center for f isheries Environment and Quality of f ishery products of Ministry Ag riculture Tian Jin 300221)

Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

本刊為北京萬(wàn)方數(shù)據(jù)股份有限公司、萬(wàn)方數(shù)據(jù)電子出版社，中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤(pán)版）電子雜志社，中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)，中國(guó)核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫(kù)入選期刊，并由其對(duì)外提供信息服務(wù)，相關(guān)著作權(quán)使用費(fèi)和稿費(fèi)由本刊一并支付，如有異議，請(qǐng)?jiān)趤?lái)稿時(shí)注明，本刊將作適當(dāng)處理?！逗颖睗O業(yè)》編輯部

基嘧啶 磺胺甲基

異噁唑 磺胺

多辛 磺胺

異噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

參考文獻(xiàn)：

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[7] 黃德鳳,戚雋淵,孫建華,等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中19種磺胺類(lèi)藥物殘留量[J].水產(chǎn)科技情報(bào),2012,40(3):148-151

[8] 吳淑秀，公茂金，朱萬(wàn)燕,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉和豬肝中9種磺胺類(lèi)藥物的殘留[J].分析試驗(yàn)室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏慶，王穎，張丹,等.高效液相色譜—紫外法對(duì)13種磺胺類(lèi)藥物的同步檢測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)2012, 39（4）:233-237

Improvement of determination of sulfa drugs residues in

aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

(Super ision and test Center for f isheries Environment and Quality of f ishery products of Ministry Ag riculture Tian Jin 300221)

Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

本刊為北京萬(wàn)方數(shù)據(jù)股份有限公司、萬(wàn)方數(shù)據(jù)電子出版社，中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤(pán)版）電子雜志社，中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)，中國(guó)核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫(kù)入選期刊，并由其對(duì)外提供信息服務(wù)，相關(guān)著作權(quán)使用費(fèi)和稿費(fèi)由本刊一并支付，如有異議，請(qǐng)?jiān)趤?lái)稿時(shí)注明，本刊將作適當(dāng)處理。《河北漁業(yè)》編輯部

基嘧啶 磺胺甲基

異噁唑 磺胺

多辛 磺胺

異噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

參考文獻(xiàn)：

[1] 白麗麗，戴華，林正峰.高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蝦中9 種磺胺類(lèi)藥物的殘留[J].藥品鑒定，2011,18（23）:60-62

[2] 段振娟,張鴻雁,王碩.動(dòng)物性食品中磺胺類(lèi)藥物殘留分析研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2007,28(6):149-152

[3] 萬(wàn)春花,龍洲雄.磺胺類(lèi)藥物殘留的色譜分析進(jìn)展[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2008,18(2):99-104

[4] 游輝,于輝,武顏文,等.快速溶劑萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牛肉中5 種磺胺類(lèi)藥物殘留[J].化學(xué)通報(bào),2010,73(9):854-857

[5] 劉正才,楊方,余孔捷,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素族抗生素藥物殘留[J].食品科學(xué),2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,張傳港,宗素艷,等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定磺胺類(lèi)藥物的離解常數(shù)及其制劑的含量[J].藥物分析雜志,2008,28(2):243～246

[7] 黃德鳳,戚雋淵,孫建華,等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中19種磺胺類(lèi)藥物殘留量[J].水產(chǎn)科技情報(bào),2012,40(3):148-151

[8] 吳淑秀，公茂金，朱萬(wàn)燕,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉和豬肝中9種磺胺類(lèi)藥物的殘留[J].分析試驗(yàn)室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏慶，王穎，張丹,等.高效液相色譜—紫外法對(duì)13種磺胺類(lèi)藥物的同步檢測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)2012, 39（4）:233-237

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aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

(Super ision and test Center for f isheries Environment and Quality of f ishery products of Ministry Ag riculture Tian Jin 300221)

Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

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