張連昌，李東韜,，趙學(xué)武,，曹新生，張 舒第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 700；海軍總醫(yī)院心臟中心，北京 00048；975部隊(duì)醫(yī)院，吉林長春 005

流體剪切應(yīng)力對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

張連昌1，李東韜1,2，趙學(xué)武1,3，曹新生1，張 舒1
1第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710032；2海軍總醫(yī)院心臟中心，北京 100048；393175部隊(duì)醫(yī)院，吉林長春 130051

目的觀察人骨肉瘤MG-63細(xì)胞在流體剪切應(yīng)力作用后，MG-63細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)譜的變化特點(diǎn)。方法MG-63細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h，隨機(jī)分成剪切應(yīng)力作用組和無剪切應(yīng)力作用對照組。將剪切應(yīng)力作用組的細(xì)胞載玻片置于流體剪切系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，流體剪切應(yīng)力設(shè)為1.5 Pa，作用時(shí)間為60 min。無剪切應(yīng)力作用組的細(xì)胞靜置相同時(shí)間。之后分別提取兩組的RNA，用Affymetrix公司的全人類基因組芯片進(jìn)行雜交，并對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果MG-63細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)譜發(fā)生改變，247個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá)，130個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(Fold Change＞2，P＜0.05)，117個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(Fold Change＜-2，P＜0.05)。差異基因主要參與細(xì)胞周期多個(gè)生物學(xué)過程的調(diào)控，包括對細(xì)胞周期進(jìn)程、周期阻滯、有絲分裂調(diào)控、G1/S轉(zhuǎn)變、有絲分裂間期等生物學(xué)過程的調(diào)控。結(jié)論流體剪切應(yīng)力可以通過改變成骨細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化等功能。

剪切應(yīng)力；基因芯片；MG-63；細(xì)胞周期

當(dāng)人進(jìn)行日?；顒?dòng)和體育鍛煉時(shí)，在體質(zhì)量和肌肉收縮的作用下，骨骼會(huì)發(fā)生形變，導(dǎo)致骨骼細(xì)胞周圍組織液發(fā)生位移，對骨骼細(xì)胞產(chǎn)生流體剪切應(yīng)力刺激[1-2]。已有研究表明，這種流體剪切應(yīng)力刺激可對骨骼細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生重要影響[3-5]。細(xì)胞周期是生命活動(dòng)的基本過程，細(xì)胞伴隨著周期的變遷進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。成骨細(xì)胞是骨組織修復(fù)過程中的主要功能細(xì)胞，是力學(xué)刺激因素的最終感受和效應(yīng)細(xì)胞，其增殖活性和功能狀態(tài)直接反應(yīng)了骨生長重建的狀態(tài)[6-7]。因此，細(xì)胞周期的調(diào)控在骨的形成和吸收這一動(dòng)態(tài)過程中起十分重要的作用。然而，在成骨細(xì)胞的周期調(diào)控中，流體剪切應(yīng)力的作用及其特點(diǎn)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察人骨肉瘤MG-63細(xì)胞在流體剪切應(yīng)力作用后，MG-63細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)譜的變化特點(diǎn)，探索流體剪切應(yīng)力對細(xì)胞周期的調(diào)控特點(diǎn)及其機(jī)制。

材料和方法

1 材料和儀器 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞系購買于ATCC。DMEM/F12混合培養(yǎng)液(Hyclone，美國)，新生牛血清(四季青，中國)，胰蛋白酶(Gibco，美國)，流體剪切系統(tǒng)為本實(shí)驗(yàn)室自行研制。

2 流體剪切應(yīng)力刺激實(shí)驗(yàn) MG-63細(xì)胞用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將MG-63細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于預(yù)置2.55 cm×2.15 cm載玻片的六孔板中，培養(yǎng)72 h。隨機(jī)分為剪切應(yīng)力作用組和無剪切應(yīng)力作用對照組。剪切應(yīng)力作用組置于流體剪切系統(tǒng)中給予剪切應(yīng)力刺激，流體剪切應(yīng)力設(shè)為1.5 Pa，作用時(shí)間為60 min。無剪切應(yīng)力作用組的細(xì)胞在六孔板中靜置相同時(shí)間以作為對照。

3 總RNA提取與檢測 用Trizol分別提取剪切應(yīng)力作用組和對照組的總RNA，用分光光度計(jì)檢測RNA樣本濃度和純度，經(jīng)過檢測樣品的濃度和純度符合基因芯片的實(shí)驗(yàn)要求，樣品于-80℃冰箱凍存。4 基因芯片雜交和掃描分析 基因芯片采用Affymetrix公司的Affymetrix Human U133plus 2.0芯片。實(shí)驗(yàn)步驟如下：1)進(jìn)行RNA抽提和純化。采用TRIZOL Reagent進(jìn)行樣品的總RNA抽提，所得總RNA經(jīng)電泳質(zhì)檢合格后使用RNeasy micro kit和RNase-Free DNase Set純化。2)進(jìn)行樣品RNA的放大和標(biāo)記。樣品RNA采用Affymetrix表達(dá)譜芯片配套試劑盒對樣品總RNA中的mRNA進(jìn)行放大、標(biāo)記和純化，獲得帶有生物素標(biāo)記的cRNA。3)進(jìn)行芯片雜交。在滾動(dòng)雜交爐中45℃，16 h滾動(dòng)雜交，雜交完成后在洗滌工作站進(jìn)行芯片洗滌。4)進(jìn)行芯片掃描。芯片結(jié)果采用GeneChip?Scanner 3000 (Cat#00-00212，Affymetrix，Santa Clara，CA，US)進(jìn)行掃描，Command Console Software 3.1 (Affymetrix，Santa Clara，CA，US)讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies，Santa Clara，CA，US)進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為MAS5。

5 數(shù)據(jù)分析 用One-Step Tukey's Biweight Algorithm對獲得的獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，F(xiàn)old Change (linear)＜-2或者Fold Change(linear)＞2，P＜0.05的基因認(rèn)為其表達(dá)差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公共數(shù)據(jù)庫查詢基因功能，用Gene Ontology功能分類標(biāo)注對差異基因進(jìn)行功能分類和生物信息學(xué)分析。

結(jié) 果

流體剪切應(yīng)力作用后，MG-63細(xì)胞中有247個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，其中130個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，117個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖1)。12個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)的基因(Fold Change＜-4)(表1)。13個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)的基因(Fold Change＞5)(表2)。通過GO分析，差異基因主要參與細(xì)胞周期多個(gè)生物學(xué)過程的調(diào)控，包括對細(xì)胞周期進(jìn)程、周期阻滯、有絲分裂調(diào)控、G1/S轉(zhuǎn)變、有絲分裂間期等生物學(xué)過程的調(diào)控(表3)。

圖 1 剪切應(yīng)力作用組與對照組的細(xì)胞周期相關(guān)基因差異表達(dá)散點(diǎn)圖Fig. 1 Scatter plots of differentially expressed genes related to cell cycle in FSS group and control group

討 論

流體剪切應(yīng)力在骨的生長和維持骨正常功能狀態(tài)中起著重要作用[8-10]。骨骼細(xì)胞特別是成骨細(xì)胞可感受流體剪切應(yīng)力，并通過多種信號(hào)通路對流體剪切應(yīng)力發(fā)生響應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等改變[11-12]。適當(dāng)增加力學(xué)刺激可引起骨形成增多、重吸收減少和骨量增加[13]。

細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶在細(xì)胞的周期調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，流體剪切應(yīng)力作用之后，MG-63細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)也發(fā)生了顯著性變化，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1，Cyclin E1，Cyclin E2，Cyclin T2)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK6、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子E2F2和E2F3的基因表達(dá)均顯著下降，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin B1，Cyclin G1，Cyclin G2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK2，CDK3，CDK4，CDK10)的基因表達(dá)均顯著上升。以往研究已證明Cyclin D1主要在G1早期表達(dá)，并與CDK2/CDK4結(jié)合成為始動(dòng)細(xì)胞周期的

啟動(dòng)子。Cyclin E主要在G1晚期和S早期表達(dá)增加，細(xì)胞進(jìn)入S期后Cyclin D1和Cyclin E將會(huì)被降解，S期晚期和G2早期Cyclin A和Cyclin B表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。細(xì)胞增殖能力增加一個(gè)重要的表現(xiàn)即為S期細(xì)胞比例增加，本實(shí)驗(yàn)中Cyclin D1、Cyclin E表達(dá)下降，Cyclin B1表達(dá)上升，與此符合。由此證明，流體剪切應(yīng)力可以通過這些基因調(diào)控成骨細(xì)胞周期，對成骨細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。

表1 與細(xì)胞周期相關(guān)的表達(dá)下調(diào)部分基因Tab. 1 Down-regulated genes related to cell cycle

表2 與細(xì)胞周期相關(guān)的表達(dá)上調(diào)部分基因Tab. 2 Up-regulated genes related to cell cycle

表3 差異表達(dá)基因的GO分析部分結(jié)果Tab. 3 GO analysis results of differentially expressed genes

除了傳統(tǒng)與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化之外，我們還發(fā)現(xiàn)了其他一些與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)也出現(xiàn)顯著性變化，這些基因包括核自身抗原精子蛋白(nuclear autoantigenic sperm protein，NASP)、MDM2結(jié)合蛋白(MDM2 binding protein，MTBP)和S激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinaseassociated protein 2，SKP2)等，這些基因主要參與了對細(xì)胞周期的精細(xì)調(diào)控。Richardson等[15]研究表明，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，NASP的蛋白表達(dá)水平在S期顯著增加，但是在G2期卻又下降，其變化的同時(shí)還伴隨mRNA表達(dá)的變化。NASP是組蛋白連接蛋白，在細(xì)胞分裂周期中具有重要的作用，參與組蛋白的核膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，將組蛋白快速有效地運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，加快細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力作用60 min后，MG-63細(xì)胞內(nèi)NASP的基因表達(dá)水平下調(diào)，這種變化的生物學(xué)意義值得我們在下一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入研究。

Agarwal等[16]的研究表明，MTBP在細(xì)胞有絲分裂和染色體分離過程中有著十分重要的作用，其過表達(dá)可延緩細(xì)胞有絲分裂過程，明顯延長細(xì)胞核膜分解的過程，滯留在有絲分裂前中期和中期相的細(xì)胞增多。他們還發(fā)現(xiàn)在有絲分裂后期MTBP表達(dá)增多還可能導(dǎo)致染色體分離異常，如形成染色體橋、多極染色體等。我們的研究證實(shí)，流體剪切應(yīng)力作用后MTBP的表達(dá)顯著降低，這有助于細(xì)胞的增殖。Hu等[17]在膽囊癌細(xì)胞上的研究表明，沉默了SKP2的表達(dá)之后，細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制，被阻滯在S期的細(xì)胞增多，G2期和M期細(xì)胞減少。由此可見SKP2在細(xì)胞有絲分裂過程中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，流體剪切應(yīng)力作用后SKP2表達(dá)顯著增加，其表達(dá)增強(qiáng)是否可以促進(jìn)S期細(xì)胞進(jìn)入G2期還有待進(jìn)一步的研究。

綜上，細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶在細(xì)胞周期中的作用已有較多的研究，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞調(diào)控相關(guān)基因如NASP、MTBP、SKP2等在力學(xué)刺激導(dǎo)致的細(xì)胞周期改變中所起作用還有待進(jìn)一步研究。適當(dāng)?shù)牧黧w剪切應(yīng)力可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化[18]。航天飛行所導(dǎo)致的失重性骨質(zhì)丟失和臨床上常見的廢用性骨質(zhì)丟失，其發(fā)生發(fā)展都與骨骼的力學(xué)刺激減弱和力學(xué)信號(hào)調(diào)控機(jī)制的變化相關(guān)。通過本研究，我們觀察到流體剪切應(yīng)力作用后，與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)譜發(fā)生了改變，這為我們開展成骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)的調(diào)控機(jī)制研究提供了參考靶點(diǎn)，進(jìn)一步的研究將為開發(fā)適當(dāng)?shù)牧W(xué)相關(guān)骨質(zhì)丟失防護(hù)措施提供參考依據(jù)。

1 張兵兵，潘君，王遠(yuǎn)亮，等．流體剪切力在骨生長、重建中的重要作用［J］.醫(yī)用生物力學(xué)，2005，20（2）：123-126．

2 Grellier M， Bareille R， Bourget C， et al. Responsiveness of human bone marrow stromal cells to shear stress［J］. J Tissue Eng Regen Med， 2009， 3 （4）： 302-309.

3 Kapur S， Baylink DJ， Lau KH. Fluid flow shear stress stimulates human osteoblast proliferation and differentiation through multiple interacting and competing signal transduction pathways［J］. Bone，2003， 32（3）： 241-251.

4 李洪鵬，許建中，周強(qiáng)，等．流體剪切應(yīng)力對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（16）：1637-1639．

5 王常德，夏亞一．流體剪切力對成骨細(xì)胞影響的研究進(jìn)展［J］.臨床骨科雜志，2009，12（3）：339-342．

6 張成俊，夏亞一，王常德，等．流體切應(yīng)力促成骨細(xì)胞通過細(xì)胞周期G1/S調(diào)控點(diǎn)機(jī)制的研究［J］.中國矯形外科雜志，2009，17（17）：1338-1343．

7 孫曉江，戴尅戎，湯亭亭．流體剪切應(yīng)力對骨細(xì)胞分子活動(dòng)的影響［J］.醫(yī)用生物力學(xué)，2007，22（1）：109-114．

8 續(xù)惠云，甕媛媛，安龍，等．流體剪切力對骨組織細(xì)胞作用的研究進(jìn)展［J］.北京生物醫(yī)學(xué)工程，2010，29（3）：318-322．

9 董海濤，盛曉赟，李鵬，等．周期性流體剪切力對成骨細(xì)胞增殖影響機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國矯形外科雜志，2012，20（3）：255-258．

10 杜挺媛，張舒，曹新生，等．流體剪切應(yīng)力對模擬微重力下MG-63細(xì)胞骨架系統(tǒng)的影響［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2012，25（4）：235-238．

11 Kang KS， Lee SJ， Lee HS， et al. Effects of combined mechanical stimulation on the proliferation and differentiation of pre-osteoblasts［J］. Exp Mol Med， 2011， 43（6）： 367-373.

12 Li Y， Ge C， Long JP， et al. Biomechanical stimulation of osteoblast gene expression requires phosphorylation of the RUNX2 transcription factor［J］. J Bone Miner Res， 2012， 27（6）： 1263-1274.

13 Li Y， Luo Y， Huang K， et al. The responses of osteoblasts to fluid shear stress depend on substrate chemistries［J］. Arch Biochem Biophys， 2013， 539（1）： 38-50.

14 易靜，湯雪明．醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)［M］. 1版. 上海：上?？萍汲霭嫔纾?009：348-360．

15 Richardson RT， Batova IN， Widgren EE， et al. Characterization of the histone H1-binding protein， NASP， as a cell cycle-regulated somatic protein［J］. J Biol Chem， 2000， 275（39）： 30378-30386.

16 Agarwal N， Tochigi Y， Adhikari AS， et al. MTBP plays a crucial role in mitotic progression and chromosome segregation［J］. Cell Death Differ， 2011， 18（7）： 1208-1219.

17 Hu R， Aplin AE. Skp2 regulates G2/M progression in a p53-dependent manner［J］. Mol Biol Cell， 2008， 19（11）： 4602-4610.

18 張超，夏亞一．流體剪切力對骨形成及修復(fù)的作用［J］.國際骨科學(xué)雜志，2009，30（5）：328-330．

Effect of flow shear stress on the expression of genes related to cell cycle in human osteosarcoma MG-63 cells

ZHANG Lian-chang1, LI Dong-tao1,2, ZHAO Xue-wu1,3, CAO Xin-sheng1, ZHANG Shu1
1Department of Aerospace Biodynamics, The Key Laboratory of Aerospace Medicine, Chinese Ministry of Education, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China;2Center of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China;3Chinese PLA 93175 Hospital, Changchun 130051, Jilin Province, China

ZHANG Shu. Email: shuzhang@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo observe the expression changes of genes related to cell cycle after exposing to fluid shear stress (FSS) in human osteosarcoma MG-63 cells.MethodsMG-63 cells were cultured for 72 h, and then they were randomly divided into the fluid shear stress group and the control group. The fluid shear stress group was exposed to 1.5 Pa FSS for 60 min, while the control group was treated with no FSS. Then RNA was extracted from the two groups, and the chip was scanned with Affymetrix gene chip and analyzed for differentially expressed genes.ResultsThe expression of genes related to cell cycle in MG-63 cells was changed. Compared with the control group, 247 genes related to cell cycle showed different expression in the FSS group. Of the 247 genes, 130 genes showed up-regulated (Fold Change＞2, P＜0.05), while the rest of them showed down-regulated (Fold Change＜-2, P＜0.05). These differential genes participated in many cell biological progresses, such as cell cycle process, cell cycle arrest, negative regulation of mitotic cell cycle, G1/S transition of mitotic cell cycle, interphase of mitotic cell cycle.ConclusionFSS can stimulate the proliferation and differentiation of MG-63 cells via regulating the expression of genes related to cell cycle.

shear stress; gene chip; MG-63; cell cycle

R 852.22

A

2095-5227(2014)11-1137-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.016

時(shí)間：2014-08-08 09:32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140808.0932.002.html

2014-05-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170889；30870595)；教育部留學(xué)回國啟動(dòng)基金(HG4406)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170889; 30870595); The Project-sponsored by SRF for ROCS, SEM(HG4406)

張連昌，男，在讀碩士。研究方向：航空航天醫(yī)學(xué)。Email: zhanglian_chang@163.com

張舒，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Email: shuzhang @fmmu.edu.cn