馬德賓，馮 帆，張 帆，楊俊蘭，史國(guó)兵，韓雅玲，張志遠(yuǎn)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 006；解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 00853

MicroRNA 122促進(jìn)吉西他濱對(duì)體外非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的殺傷作用

馬德賓1，馮 帆1，張 帆2，楊俊蘭2，史國(guó)兵1，韓雅玲1，張志遠(yuǎn)1
1沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110016；2解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853

目的探討microRNA 122(miRNA122)對(duì)細(xì)胞毒性化療藥吉西他濱對(duì)體外殺傷非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的影響。方法利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA122的表達(dá)載體；CCK-8測(cè)定系列濃度梯度吉西他濱檢測(cè)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的抑制率，計(jì)算IC50值；平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞殺傷的影響；流式細(xì)胞儀-Annexin/PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吉西他濱誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率。結(jié)果吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞具有明顯地體外殺傷作用，其IC50值為(78.65±5.25)nmol/L，轉(zhuǎn)染miRNA122能夠上調(diào)吉西他濱的活性，其IC50值為(10.26±1.18)nmol/L；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：A549細(xì)胞凋亡率誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染空載體組為26.24%±1.94%，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miRNA122組為63.30%±3.96%。miRNA122能夠顯著上調(diào)吉西他濱誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率。RT-PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染miRNA122能夠顯著上調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)miRNA122的表達(dá)水平，降低miRNA122靶基因和調(diào)控基因的表達(dá)水平。結(jié)論miRNA122能夠上調(diào)吉西他濱對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的體外殺傷作用。

微小RNA122；非小細(xì)胞肺癌；吉西他濱；

MicroRNAs在真核生物系統(tǒng)發(fā)育以及細(xì)胞增殖調(diào)控等生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，作為特殊的調(diào)節(jié)因子，miRNA也能夠參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生。miRNA122最早被發(fā)現(xiàn)與丙型肝炎病毒相關(guān)，能夠在肝癌細(xì)胞增殖調(diào)控發(fā)揮作用[1-2]。最近的研究顯示， miRNA122有可能參與肺癌細(xì)胞株的增殖[3]。吉西他濱是一種核糖核苷酸還原酶抑制劑，能夠通過(guò)阻斷DNA合成和修復(fù)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻斷其周期運(yùn)轉(zhuǎn)[4]。本研究利用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，觀察miRNA122對(duì)吉西他濱體外抗腫瘤活性的影響。

材料和方法

1 藥品和試劑 吉西他濱購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，由質(zhì)譜確認(rèn)其結(jié)構(gòu)正確，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)其純度＞98%，使用DMSO配制成3 mmol/L的母液，4℃保存；miRNA122由上海捷瑞公司化學(xué)合成；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑購(gòu)自美國(guó)Amerresco公司；雙染法細(xì)胞凋亡試劑盒(包含Annexin V Binding Buffer、FITCAnnexinV以及7-AAD Viability Staining Solution)購(gòu)自Biolegend公司；CCK-8試劑盒和Lipofectamine-RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；RTPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)試劑盒(包括SDS-蛋白電泳Loading Buffer、蛋白Marker，以及硝酸纖維素膜)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京Qiangen公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。?xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning 430641)以及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning 3337)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

2 主要設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀(Wallac公司)；TS-100倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含2 mmol/L的L-谷氨酰胺和10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中；置37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。先分別將0.5μl的Lipofectamine-RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑和200 ng質(zhì)粒(由0.5μl無(wú)血清無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基溶解與稀釋)加入到2管(含24.5μl無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基)中，混勻，室溫靜置15 min后，將兩管液體等比例混合，混勻后室溫靜置15 min。

4 細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn) 將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞接種于24孔板中，待每空細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時(shí)換新鮮培養(yǎng)基，每孔1 ml；配置系列濃度梯度的吉西他濱工作液(0.000 3 mmol/L、0.001 mmol/L、0.003 mmol/L、0.01 mmol/L、0.03 mmol/L、0.1 mmol/L以及0.3 mmol/L)，按照1∶1 000的比例加入24孔板中(每孔1 μl)，使吉西他濱的終濃度為：0.000 3μmol/L、0.001μmol/L、0.003μmol/L、0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.1μmol/L以及0.3μmol/L；藥物處理A549細(xì)胞48 h后，每孔加入30μl CCK-8試劑，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，多功能酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照組A 450 nm-藥物處理組A 450 nm)/(對(duì)照組A 450 nm-溶劑對(duì)照組A 450 nm) ×100%。

5 平板克隆實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549加入IC50濃度的吉西他濱處理48 h后，制備細(xì)胞懸液，以200個(gè)細(xì)胞/皿的密度種于9 cm直徑培養(yǎng)皿中，置37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 ～ 15 d。當(dāng)克隆肉眼可見(jiàn)時(shí)，終止培養(yǎng)。用無(wú)水乙醇固定過(guò)夜，加適量結(jié)晶紫染液染色10 ～ 30 mins，洗去染色液，空氣干燥。

6 凋亡實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[5]，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549加入IC50濃度的吉西他濱處理48 h后，消化并離心(800 r/m)，使用PBS洗3次，使用100μl Annexin V Binding Buffer重懸，加入FITC-AnnexinV和7-AAD各5μl，室溫避光染色15 min，再用500μl Annexin V Binding Buffer重懸于流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

7 反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn) 基本按照文獻(xiàn)[6-9]描述的方法，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染核酸后，收集細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，DNA電泳檢測(cè)。

8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 基本按照馮帆等[10]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一抗稀釋條件：兔抗人CycinG1單抗(1∶2 000稀釋)，兔抗人IGF1R單抗(1∶1 000稀釋)，鼠抗人CycinB1多抗(1∶1 000稀釋)，鼠抗人P-GP多抗(1∶500稀釋)，兔抗人GAPDH多抗(1∶5 000稀釋)；二抗稀釋條件：HRP-羊抗兔單克隆抗體(1∶5 000稀釋)，HRP-羊抗鼠單克隆抗體(1∶5 000稀釋)。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析比較多組件的±s，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用統(tǒng)計(jì)和繪圖軟件Origin 6.1中的Sigmoidal Fit模塊進(jìn)行回歸分析，擬合量藥物作用的效曲線并計(jì)算相應(yīng)IC50值；使用Polymoidal Fit模塊計(jì)算藥物作用曲線的R2值和P值。

結(jié) 果

1 miRNA122對(duì)吉西他濱抑制A549細(xì)胞的影響利用Origin 6.1軟件繪制吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞的劑量-抑制率曲線(圖1)。結(jié)果顯示，吉西他濱能夠劑量依賴(lài)性地殺傷A549細(xì)胞(圖1A)，其IC50值為(78.65±5.25) nmol/L，R2值和P值分別為0.94和0.005 8；轉(zhuǎn)染miRNA122的A549細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性明顯上調(diào)(圖1B)，其IC50值為(10.26± 1.18) nmol/L，R2值和P值分別為0.96和0.003 6。

2 miRNA122上調(diào)吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞克隆形成的抑制作用 檢測(cè)miRNA122對(duì)吉西他濱抑制A549細(xì)胞克隆形成的影響(圖2)。結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照相比(圖2A)，IC50濃度(80 nmol/L)的吉西他濱能夠顯著抑制A549細(xì)胞的克隆形成能力(圖2B)；轉(zhuǎn)染miRNA122能夠顯著促進(jìn)吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞克隆形成的抑制作用(圖2C)。

3 miRNA122促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡檢測(cè)miRNA122對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響(圖3)。結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照相比(圖3A)，IC50濃度(80 nmol/L)的吉西他濱能夠顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡(圖3B)；轉(zhuǎn)染miRNA122能夠顯著促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(圖3C)。吉西他濱誘導(dǎo)溶劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(圖3D)為6.24%±0.32%；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染空載體組A549細(xì)胞凋亡率為26.24%±1.94%；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miRNA122組A549細(xì)胞凋亡率為63.30%±3.96%。進(jìn)一步的RT-PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了miRNA122的轉(zhuǎn)染效率，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miRNA122的A549細(xì)胞中，miRNA122的表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖4A)，miRNA122能夠顯著下調(diào)其作用靶基因CyclinG1和IGF1R的蛋白水平(圖4B)，并能夠下調(diào)其相關(guān)蛋白CyclinB1和P-GP的表達(dá)(圖4C)。

討 論

DNA是重要生物大分子，也是重要的藥物作用靶標(biāo)，依托泊苷、氮芥、絲裂霉素C、米托蒽醌等、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、阿霉素、表柔比星、順鉑等細(xì)胞毒性化療藥物，能夠通過(guò)多種機(jī)制造成DNA損傷，抑制腫瘤細(xì)胞存活、增殖與周期運(yùn)轉(zhuǎn)[11-15]。與分子靶向藥物相比，上述細(xì)胞毒性藥物有作用濃度低、不易出現(xiàn)耐受等優(yōu)點(diǎn)。作為一種新型細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，吉西他濱一方面能夠作為核苷酸的類(lèi)似物摻入DNA中，造成DNA損傷，阻斷DNA復(fù)制與修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；另一方面，能夠作為核糖核苷酸還原酶抑制劑，通過(guò)抑制核苷酸合成阻斷DNA復(fù)制與修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]。作為重要的miRNA，miRNA122一直被認(rèn)為是肝炎，以及肝癌的重要調(diào)節(jié)因子，但近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)其在肺癌中也具有重要功能[1-2]。Ma等[3]報(bào)道，利用腺病毒在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)miRNA122，能夠阻滯細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果顯示，吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞具有明顯地體外殺傷作用，其IC50值為(78.65±5.25) nmol/L，轉(zhuǎn)染miRNA122能夠上調(diào)吉西他濱的活性，其IC50值為(10.26±1.18) nmol/L；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：吉西他濱誘導(dǎo)溶劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(圖3D)為6.24%±0.32%；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染空載體組A549細(xì)胞凋亡率為26.24%±1.94%；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miRNA122組 A549細(xì)胞凋亡率為63.30%±3.96%。

圖 1 miRNA122對(duì)吉西他濱殺傷A549細(xì)胞的影響A： A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染空對(duì)照； B： A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA122Fig. 1 Effect of miRNA122 on Gemcitabine activity in A549 cells A: A549 cells transfected with control; B: A549 cells transfected with miRNA122

圖 2 miRNA122對(duì)吉西他濱抑制A549細(xì)胞克隆形成的影響A： DMSO + A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染空對(duì)照； B：Gemcitabine + A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染空對(duì)照； C： Gemcitabine + A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA122 Fig 2 Effect of miRNA122 on Gemcitabine activity in colony formation of A549 cellsA: A549 cells which transfected with control were treated with DMSO; B: A549 cells which transfected with control were treated with Gemcitabine; C: Gemcitabine + A549 cells transfected with miRNA122 vectors

圖 3 miRNA122對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響 A： DMSO + A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染空對(duì)照； B： Gemcitabine + A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染空對(duì)照； C： Gemcitabine + A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA122； D：各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率(aP=0.012，bP=0.004 4，cP=0.009 5)Fig. 3 Effect of miRNA122 on Gemcitabine activity in apoptosis of A549 cells A: A549 cells which transfected with control were treated with DMSO; B: A549 cells which transfected with control were treated with Gemcitabine; C: Gemcitabine + A549 cells transfected with miRNA122 vectors; D: Apoptosis rates of groups(aP=0.012，bP=0.004 4，cP=0.009 5)

圖 4 miRNA122等的轉(zhuǎn)染效率 A ～ C： A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染對(duì)照或miRNA122； A： RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA122的表達(dá)水平； B： 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞中miRNA122的作用靶標(biāo)蛋白CyclinG1和IGFR的表達(dá)量； C： 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞中miRNA122調(diào)控基因CyclinB1和P-GP的表達(dá)量Fig. 4 Transfection of miRNA12 in A549 cells A-C: A549 cells which were transfected with control or miRNA122, was analyzed by WB assays. The expression level of miRNA122 was determined by RT-PCR assays (A). The expression of microRNA122 targeted genes CyclinG1 or IGFR (B), and the expression of CyclinB1 or MDR-1 (P-GP) was detected via anti-bodies (C). The β-Actin or GAPDH was used as the loading control

文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA122能夠降低多藥耐藥基因MDR(Multi-drug resistance，MDR)以及AKT、BCL-2等的表達(dá)[7,18]。為此我們進(jìn)行了A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA122后進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比，miRNA122能夠顯著下調(diào)其作用靶基因周期素G1和胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體的蛋白水平，同時(shí)也能夠下調(diào)周期素B1以及多藥耐藥基因編碼的P-糖蛋白的表達(dá)。周期素與細(xì)胞分裂和周期運(yùn)轉(zhuǎn)密切相關(guān)；IGF1R作為重要的受體酪氨酸蛋白激酶能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與侵襲；P-糖蛋白是腫瘤細(xì)胞化療藥物耐受的調(diào)控樞紐。上述結(jié)果表明，本研究轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞模型有效，miRMA122有可能通過(guò)下調(diào)上述蛋白因子的表達(dá)發(fā)揮化療藥增敏的作用。我們擬在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)miRNA122是否在A549細(xì)胞中影響細(xì)胞存活與凋亡抑制基因Survivin和抑制蛋白IAP的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

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MicroRNA122 enhances the cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells

MA De-bin1, FENG Fan1, ZHANG Fan2, YANG Jun-lan2, SHI Guo-bing1, HAN Ya-ling1, ZHANG Zhi-yuan1
1General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;2Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

s: HAN Ya-ling. Email: hanyaling@263.net; ZHANG Zhi-yuan. Email: yuan@live.cn

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA122 (miRNA122) on cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells.MethodsThe expression vector of miRNA122 was transfected using liposomes, and the CCK-8 was used to test the inhibition rate of Gemcitabine on non-small cell lung cancer A549 cells, then the score of IC50was calculated. The effect of Gemcitabine on non-small cell lung cancer A549 cells was tested by colony-forming assay, and the apoptosis rate of A549 cells induced by Gemcitabine was tested by flow cytometry-Annexin/PI experiment.ResultsTransfection of miRNA122 enhanced the cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells with the IC50values reducing from (78.6±5.25) nmol/L to (10.26±1.18) nmol/L. Moreover, transfection of miRNA122 up-regulated the apoptosis of A549 cells induced by Gemcitabine with the apoptosis rates increasing from 26.24%±1.94% to 63.30%±3.96%. The results of RT-PCR and Western Blot assays showed that the expression level of miRNA122 was up-regulated, and its targeted genes were down-regulated via transfected miRNA122.ConclusionmiRNA 122 can enhance the cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells.

microRNA122; non-small-cell lung carcinoma; Gemcitabine

R 73-3

A

2095-5227(2014)11-1160-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.021

時(shí)間：2014-08-29 17:12 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140829.1712.003.html

2014-07-21

全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”項(xiàng)目(BWS12J007)；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目(2012ZX09303016-002)；“遼寧省第一批次科學(xué)技術(shù)計(jì)劃”項(xiàng)目(2011225008)

Supported by the Military Special-purpose Program of "Twelfth Five-Year" (BWS12J007); “Major Country to Create a Special New Drugs”S&T Major Project(2012ZX09303016-002); The First Batch of Liaoning Science and Technology Project(2011225008)

馬德賓，男，博士，主治醫(yī)師。研究方向：腫瘤學(xué)。Email: madebin119@163.com；

韓雅玲，女，博士，中國(guó)工程院院士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，副院長(zhǎng)。Email: hanyaling@263.net；張志遠(yuǎn)，男，博士，主治醫(yī)師。Email: yuan@live.cn