王正冠，劉一凡，李芮冰，徐舒敏，郭宇妮，王成彬，陳宜鴻

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531醫(yī)學(xué)保障部；2臨床檢驗(yàn)科

依達(dá)拉奉對(duì)吸入性肺損傷大鼠肺組織的保護(hù)作用

王正冠1，劉一凡2，李芮冰2，徐舒敏2，郭宇妮2，王成彬2，陳宜鴻1

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531醫(yī)學(xué)保障部；2臨床檢驗(yàn)科

目的探討依達(dá)拉奉對(duì)黑火藥煙霧所致吸入性肺損傷大鼠的保護(hù)作用。方法將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、吸入性肺損傷組(S組)和依達(dá)拉奉組(E組)，每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠使用自制發(fā)煙裝置構(gòu)建吸入性肺損傷模型。造模成功后依達(dá)拉奉組按9 mg/kg腹腔注射依達(dá)拉奉注射液；正常對(duì)照組、吸入性肺損傷組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液12 ml/kg。于第7天從大鼠腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血?dú)猓环螡?干重比(lung wet-todry weight ratio，W/D)；留取各組大鼠腹主動(dòng)脈血液樣本，離心取血清，待檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。留取肺組織，制備肺組織勻漿后測(cè)定髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。取部分右肺組織，經(jīng)4%甲醛溶液固定后做病理蘇木精-伊紅(HE)染色切片，光鏡觀察。結(jié)果與S組相比，E組大鼠動(dòng)脈中PaO2水平升高(P＜0.01)，大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低并降低肺組織中MPO活性及MDA含量(P＜0.01)。光鏡下觀察，E組肺組織較S組肺組織水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少。結(jié)論依達(dá)拉奉可能通過抑制自由基的產(chǎn)生及減少部分炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，減輕煙霧吸入性肺損傷大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)，對(duì)肺組織起到一定的保護(hù)作用。

依達(dá)拉奉；吸入性肺損傷；大鼠

在戰(zhàn)爭(zhēng)或軍事演習(xí)等特殊環(huán)境中常使用大量火藥，軍事人員極易因長(zhǎng)期暴露于此環(huán)境而引發(fā)急性呼吸道和肺損傷，如化學(xué)性肺水腫、吸入性肺炎等，嚴(yán)重者甚至發(fā)展為呼吸衰竭[1]。森林大火以及日常發(fā)生的民用設(shè)施火災(zāi)所致人員死亡中，約80%是由于吸入燃燒產(chǎn)生的有毒氣體致死而非燒傷[2]。大量煙霧進(jìn)入肺部后，可引起肺組織發(fā)生過度炎癥反應(yīng)，造成機(jī)體組織損傷，其中氧自由基、細(xì)胞因子等起重要作用[3]。吸入性損傷發(fā)生后，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及缺氧中毒等因素可導(dǎo)致其他臟器繼發(fā)性損傷，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction failure，MODF)發(fā)生[4]。依達(dá)拉奉是一種有效的氧自由基清除劑，具有抑制脂質(zhì)過氧化的抗氧化能力，可以抑制腦細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞)的過氧化作用，延遲神經(jīng)細(xì)胞死亡，臨床主要用于腦缺血以及腦缺血引起的腦水腫和組織損傷[5]。急性肺損傷時(shí)自由基、細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生是加重肺組織損傷的重要因素，自由基清除劑可能對(duì)煙霧引起的急性肺損傷有治療作用。本研究擬探討依達(dá)拉奉對(duì)煙霧所致急性肺損傷的治療作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量200 ～ 220 g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。大鼠于清潔房中飼養(yǎng)，溫度21 ～ 24℃，濕度50% ～ 60%。

2 主要藥物及試劑 依達(dá)拉奉(規(guī)格：5 ml，10 mg，南京先聲東元制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20031342)，硝酸鉀、碳粉、硫磺粉(純度99.9%，200目，北京西四化工原料公司)，大鼠IL-6ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒(美國R&D公司)，大鼠髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒、大鼠丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成公司)，微量加樣器(Eooendorf)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)，酶標(biāo)儀(美國AWARENESS)

3 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備 將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、吸入性肺損傷組(S組)和依達(dá)拉奉組(E組)，每組8只?？瞻讓?duì)照組大鼠暴露于動(dòng)物煙熏箱的空氣中8 min，依達(dá)拉奉組、煙熏組置于動(dòng)物煙熏箱中，并在10 g火藥產(chǎn)生的煙霧中暴露8 min，制作黑火藥煙霧吸入性肺損傷的大鼠模型。依達(dá)拉奉組大鼠暴露后按9 mg/kg腹腔注射依達(dá)拉奉注射液；正常對(duì)照組，吸入性肺損傷組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液12 ml/kg。所有大鼠均于暴露后第7天處死。

4 動(dòng)脈血?dú)夥治?麻醉大鼠并取腹主動(dòng)脈血1 ml，于30 min內(nèi)采用羅氏Cobasb血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>

5 計(jì)算肺濕/干重比(lung wet-to-dry weight ratio，W/D)值 處死大鼠后取右肺前葉及中葉，拭干表面血液后稱濕重并記錄，然后放入60℃烘箱烘烤48 h至恒重并記錄干重，計(jì)算W/D值。

6 肺組織MPO活性及肺組織MDA含量測(cè)定 取肺組織100 mg，置于液氮中研磨后以1∶9比例加入0.9氯化鈉注射液，制成10%的肺組織勻漿，采用MPO及MDA試劑盒，按照試劑盒說明書測(cè)定肺組織MPO活性及MDA含量。

7 血清IL-6、TNF-α含量 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min后取上清液，用ELISA方法按照說明書測(cè)定大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

8 肺組織病理學(xué)檢查 觀察肺組織大體病理改變，取右肺后葉浸入4%中性緩沖甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，與對(duì)照組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)脈血?dú)夥治?與C組比較，S組PaO2明顯降低，PaCO2明顯升高(P＜0.01)。給予依達(dá)拉奉處理后，E組較S組PaO2升高(P＜0.05)且與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，E組較S組PaCO2降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2 肺W/D值 S組W/D值顯著高于C組(P＜0.01)，E組W/D值顯著低于S組(P＜0.01)。見表1。

3 大鼠肺組織MPO活性、MDA含量比較 S組MPO、MDA值顯著高于C組(P＜0.01)，E組MPO、MDA值顯著低于S組(P＜0.01)。S組與C組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.01)。見表1。

表1 各組大鼠PaO2、PaCO2、W/D值，肺組織MPO活性、肺組織MDA含量及血清TNF-α、IL-6水平Tab. 1 PaO2, PaCO2and W/D value, MPO activity and MDA content in lung tissue and levels of TNF-α and IL-6 in serum (±s，n=8)

表1 各組大鼠PaO2、PaCO2、W/D值，肺組織MPO活性、肺組織MDA含量及血清TNF-α、IL-6水平Tab. 1 PaO2, PaCO2and W/D value, MPO activity and MDA content in lung tissue and levels of TNF-α and IL-6 in serum (±s，n=8)

aP＜0.05, vs group C;bP＜0.05, vs group S;cP＜0.01, vs group C;dP＜0.01, vs group S

Group (n=8)PaO2(mmHG)PaCO2(mmHG)W/DMPO (U/g)MDA (nmol/mg prot)IL-6 (pg/ml)TNF-α(pg/ml) C87.37±3.6943.82±2.574.23±0.080.81±0.081.23±0.1523.21±1.6820.60±2.60 S59.60±9.86ac58.25±3.87ac5.95±0.46ac1.66±0.20ac2.16±0.21ac55.18±6.78ac61.88±4.91acE79.02±9.57abd53.92±8.22ac4.63±0.62abd0.91±0.12bd1.46±0.35bd34.86±4.18abcd27.24±3.32abd

4 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 S組TNF-α、IL-6水平顯著高于C組(P＜0.01)，E組TNF-α、IL-6水平顯著低于S組(P＜0.01)。E組IL-6水平較C組顯著升高(P＜0.01)，E組TNF-α水平較C組顯著升高(P＜0.05)。見表1。

5 病理學(xué)表現(xiàn) 活體解剖大鼠后觀察大鼠肺組織顏色、柔軟度及彈性。C組顏色呈微粉紅色，質(zhì)地柔軟，彈性佳。在光鏡下觀察肺組織病理切片，可見C組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡間隔一致，無炎細(xì)胞浸潤(圖1A)。S組整體呈微黑色，且有少量出血斑塊，肺泡腔增大，肺泡間隔增厚，可見炎細(xì)胞浸潤，彈性較差(圖1B)。E組大鼠肺呈肉紅色，彈性尚可。病理切片顯示肺泡間質(zhì)炎性浸潤均較S組明顯減輕，肺泡腔未見滲出(圖1C)。

討 論

當(dāng)人體吸入熱力物質(zhì)、有毒氣體或刺激性物質(zhì)后，會(huì)引起吸入性肺損傷，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等的活化和積聚，釋放髓過氧化物酶、氧自由基及多種炎性細(xì)胞因子等。同時(shí)會(huì)導(dǎo)致肺部微血管被中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附從而阻塞，加重局部組織缺血缺氧，使得血管內(nèi)皮通透性增加，進(jìn)一步加速肺組織水腫的發(fā)生，加重肺部炎癥反應(yīng)[6-7]。目前，初步使用的急性肺損傷治療藥物有血管舒張劑的吸入治療(一氧化氮吸入、前列環(huán)素吸入等)、腎上腺糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥物、酮康哇等，但總體療效不甚滿意。因此，迄今尚無安全有效的早期藥物干預(yù)和遏制疾病進(jìn)展的強(qiáng)力治療手段。依達(dá)拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是強(qiáng)效的自由基清除劑，可通過電子轉(zhuǎn)移作用清除自由基[8]。可減輕中性粒細(xì)胞浸潤及細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，抑制脂質(zhì)自由基生成，促炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)[9-10]。張中軍等[11]用依達(dá)拉奉治療燒傷休克肺損傷大鼠，用藥后6 h血漿MDA明顯降低，SOD、GSH、GSHPX明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Fang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)重度燒傷大鼠給予依達(dá)拉奉可以改善嚴(yán)重?zé)齻鸬姆嗡[和氧合減低。

本實(shí)驗(yàn)使用實(shí)驗(yàn)室自制黑火藥發(fā)煙裝置建立大鼠吸入性肺損傷模型，使用依達(dá)拉奉進(jìn)行干預(yù)[13]。血?dú)饨Y(jié)果表明，依達(dá)拉奉可顯著改善吸入性肺損傷大鼠的PaO2(P＜0.01)，使之恢復(fù)正常水平，同時(shí)降低了PaCO2水平，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。肺組織W/D值可衡量肺部發(fā)生炎癥后水腫情況。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，E組可有效降低W/D值(P＜0.01)。MPO活性可間接反映組織中性粒細(xì)胞浸潤的嚴(yán)重程度[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉能顯著降低吸入性肺損傷大鼠的MPO活性(P＜0.01)，且與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。提示依達(dá)拉奉能有效抑制中性粒細(xì)胞的滲出及MPO的釋放，減輕肺組織的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量可反映組織中自由基的多少及脂質(zhì)過氧化程度[15]。S組MDA含量增加表明吸入黑火藥煙霧可破壞肺組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，依達(dá)拉奉可降低MDA含量(P＜0.01)且與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，表明依達(dá)拉奉具有抗氧化作用。

煙霧吸入性損傷使肺泡巨噬細(xì)胞過度刺激，產(chǎn)生大量氧自由基、IL-6、TNF-α等，使肺毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致肺水腫程度加重[16]。TNF-α等多種炎性介質(zhì)以及細(xì)胞因子，致使血管通透性增高，導(dǎo)致肺水腫形成，氣道阻塞[17]。血漿中IL-6在炎性疾病中被視為預(yù)示多臟器功能衰竭及死亡的重要標(biāo)志[18]。本實(shí)驗(yàn)通過血清TNF-α和IL-6水平間接反映肺組織炎性損傷的程度。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，煙霧吸入性損傷后，血清中TNF-α和IL-6水平均升高，依達(dá)拉奉能有效降低由煙霧吸入性損傷引起的促炎因子IL-6、TNF-α水平(P＜0.01)。

圖 1 大鼠肺組織HE染色組織學(xué)觀察(HE×100) A： 正常組； B： 煙熏組； C：依達(dá)拉奉組Fig. 1 Histology of HE-stained lung tissue (HE×100) A: normal group; B: smoke group; C: edaravone group

綜上所述，由于依達(dá)拉奉能夠減輕氧自由基或活性氧的破壞作用，所以依達(dá)拉奉對(duì)吸入性肺損傷的肺組織也應(yīng)有保護(hù)作用[19]。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可通過調(diào)節(jié)炎性因子的平衡及抗氧化對(duì)黑火藥煙霧所致大鼠肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

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Protective effect of Edaravone on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats

WANG Zheng-guan, LIU Yi-fan, LI Rui-bing, XU Shu-min, GUO Yu-ni, WANG Cheng-bin, CHEN Yi-hong
1Department of Medical Security;2Department of Clinical Laboratory Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WANG Cheng-bin. Email: wangcb301@126.com; CHEN Yi-hong. Email: 9578CYH@sina.com

ObjectiveTo explore the protective effect of Edaravone on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats.MethodsTwenty four male Wistar rats were randomly divided into three groups (n=8): normal control group (C), inhalation lung injury group (S), Edaravone group (E). The rat model of inhalation lung injury was reproduced by a self-made smoke generator. Rats in E group were given 9 mg/kg of Edaravone by intraperitoneal injection. And at the same time the control group (C) and inhalation group (S) were injected normal saline (12 ml/kg). The animals were sacrificed seven days later, and the arterial blood gas values, lung wet-to-dry weight ratio (W/D) were tested. The blood samples were centrifugalized and the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) in serum were determined. The content of myeloperoxidase (MPO) activity and malondialdehyde (MDA) in lung tissue were detected. And the right lung tissue which was fixed by 4% of formaldehyde solution was observed by HE.ResultsThe level of PaO2in group E were higher than in group S (P＜0.01), however, TNF-α, IL-6 in serum, MPO activity in lung tissue and MDA content in group E were lower than in group S (P＜0.01). Histopathological observation showed less inflammatory exudates and infiltrations in group E than in group S.ConclusionEdaravone shows a protective effect on inhalation lung injury caused by black gunpowder smoke in rats by inhibiting the production of free radical and the release of inflammatory mediators.

edaravone; inhalation lung injury; rats

R 563.9

A

2095-5227(2014)11-1151-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.0191222221

時(shí)間：2014-07-15 14:45 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140715.1445.008.html

2014-05-11

全軍“十二五”醫(yī)學(xué)科研基金面上項(xiàng)目(CWS12J021)

Supported by the "12th Five-Year" Medical Science Research Foundation of PLA(CWS12J021)

王正冠，男，在讀碩士。研究方向：戰(zhàn)時(shí)煙霧吸入致肺損傷的炎癥反應(yīng)機(jī)制及預(yù)防治療措施。Email: 672354871@qq.com

王成彬，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。Email: wangcb301@126.com；陳宜鴻，男，博士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師。Email: 9578CYH@sina.com