曾啟洪 朱毅 葉少軍 周威 邵明杰 李偲 明英姿

大鼠模型是器官移植實驗研究中常用的動物模型之一，廣泛應(yīng)用于腎移植及免疫學(xué)相關(guān)的實驗研究［1-3］。目前，國內(nèi)外建立大鼠腎移植模型的手術(shù)方法有多種［4-6］，但大部分方法操作復(fù)雜、難度高且成功率低，一定程度上限制了大鼠腎移植模型的推廣應(yīng)用。本研究成功建立了一種構(gòu)建大鼠腎移植模型的新方法，具有手術(shù)操作簡單及成功率高的特點，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

成年雄性SD 大鼠24 只，成年雄性Wistar 大鼠48 只，體質(zhì)量300 ～350 g，12 ～15 周齡。實驗動物均由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境。SD 大鼠作為供體，術(shù)前正常飲食。Wistar 大鼠作為受體，術(shù)前禁食(不禁水)12 h。供體大鼠接受左側(cè)原位腎移植，自體右腎于術(shù)中切除。

1.1.2 手術(shù)器械及藥品

手術(shù)器械:顯微外科手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)、冷光單孔手術(shù)燈(江蘇醫(yī)邦醫(yī)療器械科技有限公司)、手術(shù)放大鏡(天津醫(yī)用光學(xué)儀器廠)、電動剃毛器(海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司)、醫(yī)用10-0、11-0無損傷縫合線及醫(yī)用0 號絲線(上海醫(yī)用縫合針廠)。

套管制備:利用正壓無針連接式留置針(蘇州林華醫(yī)療)制備套管，針頭用于制備動脈套管(直徑0.6 mm，長2 mm)，套管側(cè)壁剪開。透明管道用于制備靜脈套管(直徑1.5 mm，長3 mm)。外包裝透明塑料片用于制備撐開器(5 cm×1 cm)。

實驗藥品:10% 水合氯醛(西安悅來醫(yī)藥科技)、肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司)、0.9%氯化鈉注射液及5%葡萄糖注射液(湖南科倫制藥有限公司)、頭孢米諾(1 g/支，海南衛(wèi)康制藥有限公司)、離體供腎保存用枸櫞酸鹽嘌呤溶液(上海長征醫(yī)院)。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 供體大鼠手術(shù)

SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.0 mL/kg)行誘導(dǎo)麻醉，麻醉起效后，取仰臥位固定于實驗操作臺上。電動剃毛器剃去腹部毛發(fā)，絡(luò)合碘消毒后，沿腹部正中切口切開皮膚，切口范圍從劍突到恥骨聯(lián)合，自制拉鉤拉開雙側(cè)皮膚，充分暴露手術(shù)視野。將腸管用溫濕生理鹽水(25 ℃～35 ℃)紗布包裹并置于大鼠右側(cè)，游離腹主動脈及后腔靜脈間脂肪囊。鈍性分離腹主動脈，結(jié)扎前腸系膜動脈，于腹主動脈與前腸系膜動脈分叉處上方留置絲線，暫不拉緊，打一松結(jié)備用，繼續(xù)向下游離至髂總動脈分叉處，絲線結(jié)扎。游離后腔靜脈，上至肝下后腔靜脈，下至髂腰靜脈分叉處，絲線結(jié)扎。充分暴露左腎及左腎動、靜脈，先游離膀胱及輸尿管至腎門，注意保留周圍滋養(yǎng)血管及脂肪組織，鈍性分離左腎動、靜脈，分別結(jié)扎精索內(nèi)靜脈及腎上腺靜脈，采用相同方法游離右腎及右腎輸尿管。在腹主動脈上端拉緊留置絲線，將灌注針插入腹主動脈，同時將后腔靜脈靠近結(jié)扎處剪一破口，勻速灌注含肝素鈉的枸櫞酸鹽嘌呤溶液(400 U/mL)，直至雙腎顏色變灰白色、腎靜脈流出液變澄清。剪斷腹主動脈兩端結(jié)扎處、于后腔靜脈結(jié)扎處及肝下后腔靜脈結(jié)扎處，平均剪斷腹主動脈及后腔靜脈，分離出雙腎輸尿管及膀胱，放入4 ℃生理鹽水保存。

1.2.2 供腎修整

將供腎置于4 ℃生理鹽水中進行修整，盛有供腎的器皿置于無菌冰塊中保持低溫。借助手術(shù)放大鏡，游離腎動、靜脈壁上脂肪組織，注意腎門區(qū)脂肪組織盡量保留。腎動脈處修剪為保留腹主動脈瓣的圓形瓣口，腎靜脈處修剪為保留后腔靜脈的T 形血管，以輸尿管口為中心剪一直徑約0.5 cm 的圓形膀胱瓣，修整完畢，繼續(xù)低溫保存。

1.2.3 受體大鼠手術(shù)

受體Wistar 大鼠接受左側(cè)原位腎移植，自體右腎于術(shù)中切除。術(shù)前麻醉、消毒同前，取腹部正中切口，上至劍突，下至膀胱，自制拉鉤拉開皮膚。溫濕生理鹽水紗布包裹腸管并置于大鼠右側(cè)，自制撐開器充分暴露左腎，游離左腎動、靜脈。結(jié)扎左腎上腺靜脈及左精索內(nèi)靜脈，于腎門區(qū)結(jié)扎左輸尿管，在腎動、靜脈近心端用血管夾夾閉，切除左腎。含肝素鈉的生理鹽水沖洗受體腎動、靜脈殘端，將供腎置入左腎窩，覆蓋薄棉球及冰屑，保持低溫。借助手術(shù)放大鏡，先將自制動脈套管置入供腎動脈內(nèi)，在受體腎動脈壁一側(cè)以11-0 線縫合打結(jié)1 針，針頭沿套管穿入供腎動脈并穿出，另一針頭同法穿出，兩針穿出點盡量靠近，退出套管，完成腎動脈壁一側(cè)的吊線(圖1a)。將受體腎動脈牽入供腎動脈，拉緊縫合線并打結(jié)(圖1b)。供腎動脈瓣與受體動脈外膜固定3 針(圖1c)。受體腎靜脈與供體后腔靜脈近心端吻合(圖1d)，自供體后腔靜脈遠(yuǎn)心端插入自制靜脈套管，近心端穿出，將供體后腔靜脈內(nèi)近心端側(cè)套管套入受體腎靜脈內(nèi)，2 根10-0 線分別固定2 個點，雙側(cè)連續(xù)縫合并打結(jié)(圖1e)，縫合完畢退出套管，同時結(jié)扎供體后腔靜脈遠(yuǎn)心端(圖1f)。結(jié)扎前向管腔內(nèi)注入含肝素鈉的生理鹽水，先開放動脈后開放靜脈，棉球壓迫止血，溫鹽水復(fù)溫，移植腎顏色紅潤，輸尿管膀胱瓣口可見尿液流出(圖2)。將受體膀胱修剪一瓣口，同供體膀胱瓣口大小，并以10-0 線間斷縫合8 針?？p合完畢后檢查有無出血及漏尿，將受體脂肪囊包裹固定移植腎，依據(jù)出血量情況從髂腰靜脈適當(dāng)補充20 ℃含肝素鈉的5%葡萄糖溶液。分離右腎，沿右腎腎門切除右腎并絲線結(jié)扎，腹腔內(nèi)注入頭孢米諾10 mg，關(guān)腹。

1.2.4 術(shù)后處理

受體大鼠術(shù)后燈照保溫1 h，蘇醒后放入籠中單獨飼養(yǎng)，并喂食5%葡萄糖溶液。術(shù)后第1 天恢復(fù)正常飲食，并鼻飼他克莫司0.1 mg/kg，1 次/d。死亡受體大鼠行常規(guī)尸檢探查［7］。

1.3 觀察指標(biāo)

以受體大鼠術(shù)后存活3 d 為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)［8］。記錄手術(shù)時間及缺血時間，觀察受體大鼠術(shù)后存活情況。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)時間及缺血時間

本研究共實施48 例大鼠腎移植術(shù)。24 只供體大鼠平均手術(shù)時間(35±6)min，供腎修整時間(3.9±1.2)min。供腎熱缺血時間(5.7±1.5)s，冷缺血時間(52 ±6)min。受體大鼠平均手術(shù)時間(39±6)min，動脈吻合時間(6.9±2.5)min，靜脈吻合時間(14.2±2.3)min，尿路重建時間(6.6 ±1.1)min。

圖2 供腎移植成功后，輸尿管膀胱瓣口可見尿液流出

圖1 受體大鼠腎動、靜脈吻合要點

2.2 受體大鼠存活情況

48 只受體大鼠中位存活時間為6 d。術(shù)后3 d內(nèi)，2 只大鼠因血管吻合口出血死亡，2 只因移植腎動脈內(nèi)血栓形成死亡，1 只因尿瘺致腹膜炎死亡，其余43 只大鼠均獲手術(shù)成功，成功率89.6%。截至術(shù)后14 d，共7 只受體大鼠存活。

3 討 論

大鼠具有經(jīng)濟、便于飼養(yǎng)、體型適宜以及易于實施手術(shù)的優(yōu)點，因此大鼠腎移植模型是腎移植及免疫耐受等研究的首選動物模型。盡管大鼠腎移植模型有許多優(yōu)點，但這一模型的應(yīng)用還是受到限制，主要原因為建模過程尤其是血管重建過程需要難度較大的顯微外科技術(shù)，對于非顯微外科專業(yè)的初級外科醫(yī)生或從事實驗研究的科研人員，難以完成這些操作［9］。

目前建立大鼠腎移植模型的手術(shù)方式有多種，其中血管重建的方法有:端－端吻合法［10］、端－側(cè)吻合法［11］、袖套法吻合法［12］和Cuff 套管吻合法［13］，以前二者應(yīng)用最廣泛。本研究團隊經(jīng)過近1 年的研究，對多種手術(shù)方式進行了嘗試、比較，并對術(shù)中的某些操作進行了改進，摸索出一種操作簡便、易于掌握、術(shù)后存活率較高的大鼠腎移植模型建立方法。本研究采用腎動脈內(nèi)套法(受體腎動脈內(nèi)套入供體腎動脈)重建腎動脈，受體腎靜脈與供體后腔靜脈近心端行端－端吻合，供體輸尿管膀胱瓣與受體膀胱吻合進行尿路重建。腎動脈內(nèi)套法有以下優(yōu)點:(1)不需要阻斷體循環(huán)，對大鼠其他臟器影響較小;(2)降低了手術(shù)難度，不需要顯微鏡下操作，無需考慮動脈吻合閉塞;(3)借助自制動脈套管，使動脈套入相對簡單，縫線固定及3 點外膜加固使得動脈吻合良好。

在構(gòu)建大鼠腎移植模型的過程中，本中心有以下心得體會:(1)腎動脈內(nèi)套法成功的關(guān)鍵在于供腎動脈必須保持血流通暢，需在修腎及置入套管前驗證;(2)因靜脈壁較薄，腎靜脈吻合時易出現(xiàn)前后壁的縫閉，而通過后腔靜脈置入導(dǎo)管，可發(fā)揮支架作用，使靜脈吻合非常便捷;(3)靜脈吻合完畢需拔出套管并注入含肝素鈉的生理鹽水預(yù)防空氣栓塞，同時可以檢查是否存在吻合口瘺;(4)開放血供后若有出血，用棉球輕壓出血點即可，必要時可補針;(5)若移植腎灌注不佳，可以通過髂腰靜脈補充少量含肝素鈉的生理鹽水;(6)腎移植成功后，建議立即切除自體右腎，因行二期手術(shù)切除右腎會增加手術(shù)風(fēng)險和死亡率，且體外留線結(jié)扎法會增加感染機會，右腎缺血壞死亦會增加受體死亡率。

大鼠腎移植模型的成功建立依賴于簡便的操作方法、較短的手術(shù)時間以及對其他臟器功能的較小影響。本研究報道的腎動脈內(nèi)套法滿足上述要求，初學(xué)者能快速掌握，可為今后大鼠腎移植模型的研究提供參考。

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