姚丹華 李幼生 王劍 毛琦 郭明曉 張少一 孔文成 任樂樂 黎介壽

超急性異種排斥反應(yīng)(hyperacute xenograft rejection，HAXR)是決定異種器官在移植后早期能否存活的關(guān)鍵因素［1］。HAXR 是由異種天然抗體介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，通常發(fā)生在移植器官再灌注后數(shù)分鐘到24 h 內(nèi)。異種天然抗體通過識別異種器官血管內(nèi)皮細胞表面的異種抗原，引起補體系統(tǒng)的鏈式激活，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷。內(nèi)皮細胞大量損傷時，其表達的抗凝物質(zhì)如組織因子途徑抑制物、抗凝血酶、活化蛋白C、活化蛋白S 等明顯減少;而組織因子、凝血酶等促凝物質(zhì)增加，導(dǎo)致血小板、纖維蛋白等物質(zhì)在血管內(nèi)聚集，引起血栓形成［2］。同時，由于血管內(nèi)皮細胞的破壞，血液滲出到組織間隙，引起器官間質(zhì)出血。因此，HAXR 的典型病理表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞大量破壞，血管內(nèi)大量抗體、補體沉積，血管內(nèi)血栓形成及組織間質(zhì)廣泛出血［2-3］。實時檢測器官移植受體凝血功能的變化，可以從一定程度上了解HAXR 的發(fā)生情況。我們通過建立豬到食蟹猴異位節(jié)段小腸移植模型，采用常規(guī)凝血功能檢測方法和血栓彈力圖(thrombelastogram，TEG)檢測受體在移植后不同時間點的凝血功能，研究HAXR過程中受體凝血功能變化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

供體為3 只雄性白色雜種豬，5 ～6 周齡，體質(zhì)量15 ～18 kg(購自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科)。術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。受體為5 只食蟹猴，雌雄不限，3 ～4 周齡，體質(zhì)量為2.8 ～3.7 kg(購自漢南新正源生物科技有限公司)。術(shù)前8 h 禁食，自由飲水。

主要試劑為活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)檢測試劑盒以及凝血酶原時間(prothrombin time，PT)檢測試劑盒(均為美國Heamoscope 公司)。

1.2 手術(shù)方式

常規(guī)消毒、麻醉后，獲取供體末端回腸約50 cm的小腸，保留支配相關(guān)腸管的腸系膜前動、靜脈分支，分別與受體腎下腹主動脈、腎下下腔靜脈行端側(cè)吻合。保留移植小腸兩端腸管呈結(jié)扎狀態(tài)，不與受體腸管吻合。

1.3 凝血功能檢測

分別采集受體移植前以及移植小腸再灌注后15，30，60，120 min 各時間點的血液標(biāo)本。經(jīng)頸外靜脈取血約2.5 mL，裝入枸櫞酸鈉抗凝采血管，立即行常規(guī)凝血功能檢測和TEG 檢測。

1.4 移植小腸存活情況的判斷

由兩位經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師連續(xù)觀察移植小腸的存活情況，計算受體移植小腸的存活時間。同時發(fā)現(xiàn)腸黏膜散在出血點、無肉眼可見正常黏膜、腸壁及腸系膜血管搏動消失時，可診斷為移植小腸丟失。當(dāng)判定為移植小腸丟失時，靜脈注射氯化鉀6 g，處死受體。本研究符合動物實驗相關(guān)倫理要求。

2 結(jié) 果

2.1 受體凝血功能的變化

本研究共行豬到食蟹猴異種小腸移植術(shù)5 例。血管吻合成功率為100%，移植小腸中位存活時間為165 min (55 ～245 min)。受體移植前以及移植小腸再灌注后15，30，60，120 min 凝血功能監(jiān)測顯示，受體纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)水平、血小板(platelet，Plt)計數(shù)以及抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT Ⅲ)活性在移植小腸再灌注后，呈逐漸下降趨勢，詳見表1。Fib 術(shù)前初始值為(1.81 ±0.24)g/L，再灌注后120 min 降至最低，為(0.76±0.17)g/L;Plt術(shù)前初始值為(340 ±81)×109，再灌注后120 min降至最低，為(155 ±7)×109;AT Ⅲ術(shù)前初始值為(100 ±19)%，再灌注后30 min 降至最低，為(54 ±16)%。受體PT、APTT、D-二聚體以及國際標(biāo)準化比值(international normalized ratio，INR)在移植小腸再灌注后，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。PT 術(shù)前初始值為(11 ±2)s，再灌注后30 min 升至最高，為(20 ±5)s;APPT 術(shù)前初始值為(21 ±3)s，再灌注后30 min 升至最高(88 ±29)s;D-二聚體術(shù)前初始值為(0.09 ±0.07)mg/L，再灌注后60 min 升至最高，為(0.70 ±0.49)mg/L;INR 初始值為1.0 ± 0. 2，再灌注后30 min 升至最高，為1.7 ±0.3。

受體TEG 指標(biāo)中，R 值、K 值及LY30 呈逐漸升高的趨勢，最大振幅(maximun amplitude，MA)數(shù)值呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(表2)。R 值術(shù)前初始值為(6.9 ±1.3)min，再灌注后120 min 升至最高，為(16.8 ±2.7)min;K 值術(shù)前初始值為(2 ±1)min，再灌注后120 min 升至最高，為(15 ±5)min;LY30術(shù)前初始值為(4±2)%，再灌注后60 min 升至最高，為(31 ±7)%;MA 數(shù)值術(shù)前初始為(63 ±5)mm，再灌注后60 min 降至最低，為(25 ±16)mm。TEG 曲線提示，移植前受體凝血功能正常，移植小腸再灌注15，30 min 后，受體凝血功能呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，合并纖溶亢進;移植小腸再灌注后60，120 min，受體凝血功能表現(xiàn)為消耗性低凝狀態(tài)(圖1)。

表2 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點血栓彈力圖指標(biāo)

表2 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點血栓彈力圖指標(biāo)

注:MA.最大振幅

例數(shù) R 值(min)K 值(min)LY30(%)MA(%)63 ± 5再灌注后15 min 5 9.5 ±3.2 2 ±1 7 ±3 54 ± 8再灌注后30 min 5 13.0 ±2.2 8 ±2 13 ±5 38 ± 9再灌注后60 min 4 14.3 ±2.1 13 ±3 31 ±7 25 ±16再灌注后120 min 3 16.8 ±2.7 15 ±5 30 ±6移植前 5 6.9 ±1.3 2 ±1 4 ±2 28 ±16

圖1 1 例受體食蟹猴血栓彈力圖曲線的變化趨勢

2.2 移植小腸的病理表現(xiàn)

本研究中，所有受體再灌注后15 min，均發(fā)現(xiàn)典型的HAXR 病理表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為移植小腸黏膜充血、水腫、散在出血點以及間質(zhì)出血表現(xiàn)(圖2)。供體正常小腸黏膜為淡粉紅色，無出血點，黏膜皺襞清晰可見(圖3a)。移植小腸再灌注后15 min，腸黏膜呈深粉紅色，伴輕微水腫(圖3b);再灌注后30 min，腸黏膜水腫較前加重，并伴有瘀血及點狀出血(圖3c);再灌注后120 min，腸黏膜水腫嚴重，出血連成片，伴腸腔內(nèi)滲血(圖3d)。再灌注后120 min，移植小腸大體觀可見水腫，漿膜層點狀出血，腸系膜大量出血點伴水腫(圖4)。

表1 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點常規(guī)凝血指標(biāo)(ˉx±s)

圖2 受體食蟹猴移植小腸術(shù)后發(fā)生超急性排斥反應(yīng)的病理表現(xiàn)(HE ×100)

圖3 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點移植小腸腸黏膜病理表現(xiàn)

圖4 受體食蟹猴移植腸再灌注后120 min 大體觀

3 討 論

異種器官移植有望成為解決目前供器官嚴重短缺困難的有效手段之一［4］。但是，由于異種器官細胞表面存在天然抗原，可導(dǎo)致異種器官移植后早期即出現(xiàn)以內(nèi)皮細胞破壞、血管內(nèi)血栓、間質(zhì)出血為特征的HAXR［5］。目前，尚沒有較好的血清學(xué)指標(biāo)來反映異種器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生情況，大多只能根據(jù)移植器官組織病理改變來判斷排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。但是，對于某些特殊器官，難以通過反復(fù)活檢獲得足夠的組織標(biāo)本，加大了診斷排斥反應(yīng)的難度。雖然在異種小腸移植動物實驗中，我們可以反復(fù)多次獲取小腸組織標(biāo)本，但是從病理學(xué)角度判斷移植小腸的存活情況存在一定的滯后性，無法實時監(jiān)測移植小腸排斥反應(yīng)發(fā)生情況。由于HAXR引起的血管內(nèi)血栓和移植器官間質(zhì)出血是最終導(dǎo)致異種移植物丟失的原因，故檢測或調(diào)節(jié)凝血指標(biāo)有助于判斷和干預(yù)HAXR。Mohiuddin 等［6］將轉(zhuǎn)基因豬(GTKO/hCD46)的心臟異位移植于狒狒體內(nèi)，移植心臟存活時間達146 d;而將GTKO/hCD46 轉(zhuǎn)基因豬的基礎(chǔ)上再表達人血栓調(diào)節(jié)蛋白的3 系轉(zhuǎn)基因豬的心臟移植于狒狒體內(nèi)，移植心臟的存活時間可超過1 年［7］。事實證明，凝血功能的調(diào)節(jié)可以有效減少HAXR 的發(fā)生，并延長移植物的存活時間。研究異種移植受體在移植后凝血功能的變化，可能有助于指導(dǎo)抗凝治療，延長移植物存活期［8］。

本研究采用常規(guī)方法檢測食蟹猴受體各項凝血指標(biāo)，同時還采用TEG 評估凝血酶、血小板及纖維蛋白功能以及纖維蛋白溶解情況，觀察受體不同時間點全方面的凝血狀態(tài)。與傳統(tǒng)凝血項目檢測相比，TEG 將凝血動力學(xué)過程描記為曲線，從而清楚地反映全血凝血過程，包括從凝血開始至血凝塊降解的全過程，涵蓋凝血級聯(lián)反應(yīng)與血小板相互作用的綜合結(jié)果，反映參與凝血過程所有物質(zhì)的綜合狀態(tài)［9-10］。TEG 中的R 值反應(yīng)凝血因子功能，K 值反應(yīng)血凝塊形成速率，MA 反映纖維蛋白和血小板血凝塊最大強度，LY30 值反映纖維蛋白降解速率。本研究中，移植小腸再灌注后15 min，TEG 曲線顯示R 值及K 值減小，LY30 增高，提示受體凝血因子大量活化，纖維蛋白和血小板開始聚集，同時出現(xiàn)繼發(fā)性纖溶亢進，受體此時處于彌散性血管內(nèi)凝血的高凝期。移植小腸再灌注后60，120 min，TEG 曲線提示受體處于消耗性低凝狀態(tài)。Spiezia 等［8］使用TEG 技術(shù)監(jiān)測豬到食蟹猴異種腎移植后受體的凝血功能，通過及時發(fā)現(xiàn)受體消耗性凝血功能障礙，及時對癥治療，成功延長了受體的生存時間?？梢奣EG 可以實時、全面評估凝血狀態(tài)，在指導(dǎo)異種器官移植抗HAXR 治療方面，前景廣闊，意義重大。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)受體凝血功能隨HAXR 的發(fā)生而出現(xiàn)逐漸惡化的趨勢，因此，我們認為凝血功能可以在一定程度上反映HAXR 的發(fā)生情況。采用常規(guī)凝血指標(biāo)結(jié)合TEG 來監(jiān)測凝血功能，從而進行抗凝、止血干預(yù)，可能會有利于延長異種移植小腸存活時間。

1 Vaughan HA，Loveland BE，Sandrin MS. Gal alpha(1，3)Gal is the major xenoepitope expressed on pig endothelial cells recognized by naturally occurring cytotoxic human antibodies［J］. Transplantation，1994，58(8):879-882.

2 Pierson RN，Dorling A，Ayares D，et al. Current status of xenotransplantation and prospects for clinical application［J］.Xenotransplantation，2009，16(5):263-280.

3 Yazaki S，Iwamoto M，Onishi A，et al. Production of cloned pigs expressing human thrombomodulin in endothelial cells［J］.Xenotransplantation，2012，19(2):82-91.

4 Yamada K，Scalea J. Current progress in xenogeneic tolerance［J］.Curr Opin Organ Transplant，2012，17(2):168-173.

5 Dai Y，Vaught TD，Boone J，et al. Targeted disruption of the alpha 1，3-galactosyltransferase gene in cloned pigs［J］. Nat Biotechno，2002，20(3):251-251.

6 Mohiuddin MM，Singh AK，Corcoran PC，et al. Role of anti-CD40 antibody-mediated costimulation blockade on non-Gal antibody production and heterotopic cardiac xenograft survival in a GTKO.hCD46Tg pig-to-baboon model［J］. Xenotransplantation，2013，21(1):35-45.

7 Mohiuddin MM， Singh AK， Corcoran PC， et al. One-year heterotopic cardiac xenograft survival in a pig to baboon model［J］.Am J Transplantation，2014，14(2):488-499.

8 Spiezia L，Boldrin M，Radu C，et al. Thromboelastographic evaluation of coagulative profiles in pig-to-monkey kidney xenotransplantation［J］. Xenotransplantation，2013，20(2):89-99.

9 Gonzalez E，Pieracci FM，Moore EE，et al. Coagulation abnormalities in the trauma patient:the role of point-of-care thromboelastography［J］. Semi Thromb Hemost，2010，36(7):723-737.

10 Kashuk JL，Moore EE，Sawyer M，et al. Postinjury coagulopathy management:goal directed resuscitation via POC thrombelastography［J］. Ann Surg，2010，251(4):604-614.