趙家寧徐寶山 曾 超楊 強馬信龍張春秋李秀蘭張 揚

新型絲素蛋白支架復合兔髓核細胞體內(nèi)初步構建組織工程髓核的研究

趙家寧1徐寶山2△曾 超1楊 強2馬信龍2張春秋3李秀蘭2張 揚2

目的 探討新型絲素蛋白多孔支架復合經(jīng)PKH26標記的兔髓核細胞初步構建組織工程髓核的可行性。方法消化分離兔髓核細胞，培養(yǎng)獲取P1代細胞，對P1代髓核細胞行番紅O以及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色；PKH26標記兔髓核細胞，MTT法檢測標記前后髓核細胞增殖情況，將標記后的細胞接種支架，體外培養(yǎng)4 d后，將細胞-支架復合物植入裸鼠皮下，體內(nèi)培養(yǎng)12周后，進行活體熒光成像技術檢測、HE染色、甲苯胺藍染色、番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色。結果P1代髓核細胞番紅O染色陽性，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性；標記后細胞熒光強度分布均勻，標記前后髓核細胞光密度（OD）值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；活體成像技術顯示裸鼠皮下植入的細胞-支架復合體呈現(xiàn)強烈熒光；HE染色見多孔支架內(nèi)壁有大量髓核細胞填滿并分泌大量細胞外基質(zhì)；甲苯胺藍染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色均呈陽性，細胞周圍大量細胞外基質(zhì)分泌。結論以新型絲素蛋白多孔支架復合兔髓核細胞經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)形成的類髓核樣組織，可用于組織工程化髓核的構建。

絲素蛋白；組織工程；免疫組織化學；髓核；PKH26

椎間盤退變性疾病是骨科常見病，其大多起源于髓核組織的退變。髓核組織一旦出現(xiàn)退變，便難以逆轉(zhuǎn)。目前治療方法一般采取脊柱融合、全間盤置換或髓核置換手術等，但這些方法僅能在一定程度上緩解癥狀，并不能完全恢復椎間盤的功能[1-2]。近年來，組織工程技術成為一種修復退變椎間盤的新方法[3]。髓核組織工程的目標是重建包括材料及細胞的復雜結構并用以替代退變的髓核，其中支架材料的選擇是組織工程研究的關鍵[4]。絲素作為一種天然蛋白質(zhì)，具有無抗原性、化學性能穩(wěn)定及生物學相容性良好等優(yōu)點而被廣泛應用[5]。本實驗以絲素蛋白為材料制備多孔支架，并復合PKH26標記的兔髓核細胞體內(nèi)構建組織工程髓核，探討絲素蛋白多孔支架復合兔髓核細胞體內(nèi)長期培養(yǎng)構建組織工程髓核的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 新西蘭大白兔5只，雄性，3～4周齡（280～300 g），由天津市天津醫(yī)院動物房提供；裸鼠4只，雄性，6周齡，由天津市血液病研究所動物實驗室提供。

1.2 試劑和儀器 FD-1冷凍干燥機（北京博醫(yī)康技術公司），速眠新注射液、戊巴比妥鈉（軍事醫(yī)學科學院），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO公司，美國），EDTA、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、甲苯胺藍染液、番紅花O染液、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國），鼠抗人Ⅱ型膠原抗體（博士德，武漢），CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell公司，德國），恒溫搖床（Heidolph公司，德國），IX53倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），MRX-HD全自動酶標分析儀（Biotek公司，美國），細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司，美國）。

1.3 兔髓核原代細胞分離和培養(yǎng) 將新西蘭白兔處死后，取其T5～L5間脊柱，切除周圍組織，尖刀切開纖維環(huán)前側(cè)，用無菌小刮匙將髓核刮出，隨即放入含有10萬U/L青霉素的Hank’s液漂洗2遍，將其剪碎成約1 mm3的碎塊，加入濃度為0.2％的Ⅱ型膠原酶，與髓核組織以3∶1體積充分混合，37℃消化5 h，至髓核組織基本消化完全，用200目濾網(wǎng)過濾，收集細胞懸液，1 000 r/min離心7 min，棄上清，用含10％胎牛血清（FBS）的高糖DMEM重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，接種至細胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換1次10％FBS高糖DMEM。

1.4 細胞學及免疫組織化學染色 待兔髓核原代細胞長滿瓶底80％后，消化傳代，得到P1代細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為1×104/mL，用吸管將細胞懸液滴加在預先放置于24孔板底的玻片上，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1日滴加完全培養(yǎng)液1.5 mL。鏡下觀察，至細胞長滿玻片30％左右，棄培養(yǎng)液，用Hank’s沖洗2遍，滴加4％多聚甲醛固定20 min，PBS緩沖液再沖洗3遍，晾干，進行番紅O及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。

1.5 髓核細胞的PKH26標記 取P1代髓核細胞約2×107個，1 000 r/min離心7 min，用不含胎牛血清的高糖DMEM洗滌，1 000 r/min再次離心7 min，除去上清，重復3次，用1 mL Diluent C溶液將細胞沉淀重懸并與1 mL濃度為6×10-6mol/L的PKH26染料混勻，室溫孵育5 min后加入2 mL山羊血清終止反應，然后加入4 mL 10％FBS高糖DMEM，1 000 r/ min離心7 min，去上清，反復洗滌2次，標記后的細胞作爬片，剩余接種支架。

1.6 標記前后髓核細胞MTT檢測 取標記后的髓核細胞懸液，調(diào)至密度2×104個/mL，接種至96孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。每組取4孔，每孔加入25 μL MTT溶液，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后棄，每孔加入100 μL DMSO，待藍紫色結晶物溶出后，于酶聯(lián)免疫檢測儀測定在570 nm波長處的光密度（OD）值，同法以標記前髓核細胞作為對照組。

1.7 細胞支架復合體的制備 在之前的研究中，本課題組已成功制備出直徑5 mm，高3 mm的新型絲素蛋白多孔支架[6]。將滅菌消毒后的絲素蛋白多孔支架置于48孔板中，用高糖DMEM在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中浸泡24 h。接種時，用濾紙吸除支架水分。P1代髓核細胞懸液調(diào)以1×107/mL濃度注射入支架中央部，然后將細胞-支架復合體置入37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，沿壁加入2 mL 10％FBS高糖DMEM，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

1.8 細胞-支架復合體裸鼠皮下植入實驗及評估

1.8.1 皮下植入實驗 選用10％水合氯醛以0.3 mg/g劑量麻醉，裸鼠背部常規(guī)碘伏消毒，脊柱兩側(cè)上下各切開大小約為8 mm的切口，共4個，分離裸鼠皮下組織并將2個細胞-支架復合體植入下方切口皮下。同時在上方切口皮下植入2個不含標記細胞的空白支架，作為對照組，見圖1。

Fig.1 Subcutaneous implantation in nude mice圖1 裸鼠皮下植入

1.8.2 活體熒光成像系統(tǒng)分析評估 細胞-支架復合體裸鼠皮下植入12周后，經(jīng)乙醚麻醉，置于Xenogen IVIS 200活體成像系統(tǒng)內(nèi)觀察。裸鼠側(cè)臥位于成像系統(tǒng)內(nèi)，系統(tǒng)自動分析成像結果。

1.8.3 組織學及免疫組織化學 樣本經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定12 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片，再經(jīng)脫蠟、乙醇水化等處理后，進行HE、番紅O、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色，封片后于光鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本資料t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞學及免疫組織化學染色 P1代髓核細胞番紅O染色為陽性，見圖2A。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色呈陽性，見圖2B。

2.2 髓核細胞的PKH26標記 PKH26標記后的P1代兔髓核細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光且分布均勻，見圖3。

2.3 標記前后髓核細胞MTT檢測 兔髓核細胞PKH26標記前后，第1、3、5、7天OD值比較差異均無統(tǒng)計學意義（t分別為0.056、1.479、1.608、2.002，P＞0.05，n=5），表明標記前后髓核細胞增殖無明顯差異，見圖4。

Fig.4 Nucleus pulposus cells before and after labeling detected by MTT assay圖4 標記前后髓核細胞MTT檢測

2.4 活體熒光成像分析 裸鼠皮下植入12周后，活體熒光成像可見實驗組中髓核支架部位強烈熒光，且熒光強度由內(nèi)向外逐步減弱，而對照組支架部位未見熒光，見圖5A。裸鼠體內(nèi)取出細胞-支架復合體可見支架完整，表面光滑富有色澤，見圖5B。

Fig.5 Nude mice in vivo fluorescence imaging and cell-scaffold complexes圖5 裸鼠活體熒光成像及細胞-支架復合物大體觀

2.5 組織學及免疫組織化學 HE染色見多孔支架內(nèi)壁有大量髓核細胞填滿并分泌細胞外基質(zhì)，見圖6A；番紅花O染色、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性，見圖6B、C、D。

3 討論

3.1 絲素蛋白在組織工程中的應用 組織工程主要包括生物支架材料、種子細胞和生物活化因子3個重要部分，其中支架材料為種子細胞提供一種良好的微環(huán)境供其黏附、生長以及增殖，同時支架自身逐漸降解吸收，最后被新生的組織替代[7]。絲素蛋白作為一種良好的細胞生長介質(zhì)，以其良好的生物相容性及可降解性，利于細胞的黏附及生長繁殖，在組織工程中廣泛應用[8]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞在絲素支架上具有成軟骨特性并且能在支架上黏附、增殖、分泌蛋白多糖及Ⅱ型膠原。Feng等[10]運用一種新型納米纖維支架在體外和大鼠體內(nèi)原位移植中再生了髓核樣組織。Chang等[11]將牛的纖維環(huán)細胞接種在絲素蛋白多孔支架上，經(jīng)過體外8周培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)細胞可在絲素蛋白多孔支架上黏附、增殖并分泌大量細胞外基質(zhì)。苗宗寧等[12]將成軟骨方向誘導后兔骨髓間充質(zhì)干細胞與絲素蛋白材料復合培養(yǎng)，植入兔股骨髁間軟骨缺損處，12周后發(fā)現(xiàn)絲素蛋白支架材料已逐步被吸收，復合體與周圍軟骨組織色澤相近。本實驗以絲素蛋白結合石蠟致孔等技術制備三維多孔支架。HE染色觀察支架多孔結構明顯，掃描電鏡觀察支架呈多孔結構，且大孔之間貫通性良好，利于髓核細胞遷入多孔支架內(nèi)，同時也能實現(xiàn)營養(yǎng)成分與新陳代謝產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)運。

3.2 PKH26標記兔髓核細胞 PKH26熒光標記是組織工程中常用的一種細胞標記技術，在構建組織工程軟骨[13]和神經(jīng)[14]等方面應用廣泛。它以其操作簡便、標記迅速以及不影響細胞生物學功能等優(yōu)點廣泛運用于體內(nèi)示蹤。同時，其作為一種親脂性染料，能夠不可逆地結合細胞膜，并在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光。丁曉明等[15]用PKH26標記牛尾椎間盤髓核細胞，分別培養(yǎng)1、7、14、28 d，經(jīng)MTT、PCR檢測等證實經(jīng)PKH26標記后，牛尾髓核細胞形態(tài)、表型、增殖及蛋白表達無影響。

實驗中筆者以適當?shù)臉擞洕舛葘ν盟韬思毎M行了熒光標記，標記后的細胞在鏡下顯示熒光強烈并且均勻，MTT檢測顯示了細胞標記前后生長曲線無明顯差異，表明PKH26對兔髓核細胞的活性和增殖無影響。裸鼠體內(nèi)植入12周后，將其進行活體熒光成像檢測，發(fā)現(xiàn)對照組未顯現(xiàn)熒光，而實驗組顯示支架部分有明顯熒光，表明接種的髓核細胞在裸鼠體內(nèi)大量存活。采用空白支架作為對照，排除了實驗中支架非特異性熒光顯色的可能。

3.3 細胞-支架復合物的體內(nèi)培養(yǎng) 髓核組織呈膠狀，具有高度黏彈性[16]。其含水豐富，主要包含髓核細胞、蛋白聚糖以及膠原3種成分[17]。髓核細胞能夠維持髓核組織功能及結構的穩(wěn)定，同時能夠分泌大量的細胞外基質(zhì)，如蛋白多糖、膠原等。裸鼠皮下植入12周后，細胞-支架復合物HE染色示支架內(nèi)部大量髓核細胞填充，并分泌大量細胞外基質(zhì)，說明細胞與支架生物相容性良好，并能在體內(nèi)生長增殖。番紅花O染色及甲苯胺藍染色呈陽性，說明細胞-支架復合物體內(nèi)培養(yǎng)12周后，仍能大量分泌蛋白多糖。Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性表明髓核細胞在支架上分泌Ⅱ型膠原。髓核細胞所分泌的基質(zhì)與正常髓核組織的細胞外基質(zhì)成分相同。

綜上所述，三維絲素蛋白多孔支架以其高孔隙率及良好的孔間貫通性為細胞提供了一個合適生長環(huán)境，且對髓核細胞增殖無影響。絲素蛋白多孔材料復合兔髓核細胞體內(nèi)培養(yǎng)形成的類似髓核的組織，可用于組織工程化髓核的構建。

Fig.2 The staining for the P1 generation nucleus pulposus cells(inverted phase contrast microscope×100)圖2 P1代髓核細胞染色（倒置相差顯微鏡×100）

Fig.3 The P1 generation of PKH26 labeled nucleus pulposus cells(fluorescence microscope×100)圖3 PKH26標記的P1髓核細胞（熒光顯微鏡×100）

Fig.6 The histology and immunohistochemistry detection of cell-scaffold complexes(inverted phase contrast microscope×100)圖6 細胞-支架復合體的組織學及免疫組織化學檢測（倒置相差顯微鏡×100）

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（2014-07-11收稿 2014-07-31修回）

（本文編輯 李鵬）

Preliminary Construction of Tissue Engineering Nucleus Pulposus Combining Silk Fibroin Porous Scaffold with Rabbit Nucleus Pulposus Cells

ZHAO Jianing1,XU Baoshan2△,ZENG Chao1,YANG Qiang2,MA Xinlong2,ZHANG Chunqiu3,LI Xiulan2,ZHANG Yang21 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Tianjin Hospital;3 Tianjin University of Technology
△

E-mail：xubaoshan99@126.com

ObjectiveTo investigate the feasibility of construction of tissue engineering nucleus pulposus by combining the novel silk fibroin porous scaffold with PKH26 labeled rabbit nucleus pulposus cells.MethodsRabbit nucleus pulposus cells were isolated and cultured,then the passage 1 nucleus pulposus cells were stained with safranin O and typeⅡcollagen immunohistochemical staining.The isolated rabbit nucleus pulposus cells were labeled with PKH26.MTT assay was used for examining the proliferation of the nucleus pulposus cells before and after labeling.Labeled cells were inoculated in the scaffold,cultured for 4 days and then the cell-scaffold complexes were implanted subcutaneously into nude mice. After 12 weeks of in vivo culture,the cell-scaffold complexes were detected by in vivo imaging technology,H＆E staining, toluidine blue staining,safranin O staining and collagen typeⅡimmunohistochemical staining.ResultsSafranin O staining and typeⅡcollagen immunohistochemical staining of the passage 1 nucleus pulposus cells were positive.The fluorescence intensity of labeled cell was distributed,and the difference of OD value of nucleus pulposus cells was not statistically significant before and after labeling(P＞0.05).The in vivo imaging technique showed a strong fluorescencea in porous scaffold.H＆E staining of cell-scaffold complexes showed that the scaffolds were filled with a large number of nucleus pulposus cells and large amount of extracellular matrix.Toluidine blue staining,safranin O staining and typeⅡcollagen immunohistochemical staining were positive,and large amount of extracellular matrix was secreted around the cells.ConclusionThe new silk fibroin porous scaffold with rabbit nucleus pulposus cells in vivo culture formed nucleus pulposus like tissue,which can be used for construction of tissue engineering nucleus.

silk fibroins；tissue engineering；immunohistochemistry；nucleus pulposus;PKH26

R329-33，R349.89

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.006

國家自然科學基金資助項目（81272046,31300798,31000432）；中國博士后科學基金項目（2011M500530，2012T50221）；天津市衛(wèi)生局科技基金（2013KR16）

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院；3天津理工大學

△通訊作者 E-mail：xubaoshan99@126.com