徐衛(wèi)國(guó)苗 娜孫 紅劉 云張世偉郝小惠

神經(jīng)纖毛蛋白1、2在大腸癌組織中的表達(dá)及意義

徐衛(wèi)國(guó)1苗 娜1孫 紅2劉 云1張世偉1郝小惠3

目的 探討神經(jīng)纖毛蛋白（NRP）-1、2在大腸癌組織中的表達(dá)及其與微血管密度（MVD）的相關(guān)性，以揭示NRP-1、2與腫瘤血管生成的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)66例大腸癌患者的癌組織、癌旁組織及正常組織中NRP-1、2的表達(dá)情況，以CD105標(biāo)記腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)MVD值。結(jié)果（1）NRP-1、NRP-2在大腸癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為71.2％、25.8％、0，及80.3％、15.2％、0，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。（2）MVD在大腸癌組織、癌旁組織及正常組織中的計(jì)數(shù)分別為35.682±5.542、14.485±3.301、6.864±1.771，各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=986.654，P＜0.01）。（3）不同年齡、性別、腫瘤的部位及分化程度的患者NRP-1、2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤＞5 cm的患者NRP-1陽(yáng)性表達(dá)率較高，腫瘤侵及漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NRP-1、2的陽(yáng)性表達(dá)率均較高，不同的Dukes分期患者NRP-1、2陽(yáng)性表達(dá)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（4）大腸癌患者不同性別、年齡及腫瘤大小、部位和組織分化程度MVD的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而浸潤(rùn)到漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期高的患者相關(guān)MVD的表達(dá)增加(P＜0.01)。（5）大腸癌組織中NRP-1（r=0.599，P＜0.01）、NRP-2（r=0.484，P＜0.01）的表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論NRP-1、2在大腸癌的血管新生中起重要作用，并且與大腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

結(jié)直腸腫瘤；神經(jīng)纖毛蛋白質(zhì)類；免疫組織化學(xué)；大腸癌；微血管密度；腫瘤血管生成；血管內(nèi)皮細(xì)胞

大腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居高不下，而治療多以手術(shù)為主[1]。神經(jīng)纖毛蛋白(Neuropilins,NRPs)為一種非酪氨酸依賴性激酶，是Ⅲ型Sema分子與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族分子共享的一類跨膜非信號(hào)傳導(dǎo)受體。其家族包括兩個(gè)成員即NRP-1和NRP-2，其中NRP-1主要表達(dá)在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤血管的新生及腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]，而NRP-2主要表達(dá)在靜脈及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，可能與腫瘤淋巴管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[3]。本研究前期發(fā)現(xiàn)，NRP-1 mRNA表達(dá)水平與大腸癌組織的微血管密度(MVD)呈正相關(guān)[4]。本文旨在探討NRP-1和NRP-2在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，及其與臨床病理特征的聯(lián)系和血管轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院2011年11月—2013年2月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的大腸癌標(biāo)本66例，包括癌組織、癌旁組織及正常組織。其中男39例，女27例；年齡40～87歲，平均年齡63.5歲，其中≤50歲者11例，＞50歲者55例。所有病例術(shù)前均未接受化療、放療、免疫治療及中醫(yī)中藥治療。

1.2 臨床病理特征 66例大腸癌病例中，原發(fā)腫瘤直徑≤5 cm者30例，＞5 cm者36例；腫瘤位于結(jié)腸者45例，位于直腸者21例；腫瘤侵及漿膜以內(nèi)者14例，侵及漿膜及漿膜外者52例；病理分級(jí)：高分化癌24例，中低分化癌42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；腫瘤分期采用Dukes分期標(biāo)準(zhǔn)：A期+B期30例，C期+D期36例。

1.3 試劑來源及實(shí)驗(yàn)方法 SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑及CD105抗體購(gòu)于北京中杉金橋公司，兔抗人NRP-1蛋白多克隆抗體購(gòu)于Epitmics公司，鼠抗人NRP-2蛋白多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化染色法檢測(cè)NRP-1、2。CD105免疫組化染色，于光鏡100倍視野下尋找微血管分布均勻區(qū)域，后在200倍（每個(gè)視野面積為0.785 mm2）視野下選取與周圍腫瘤和結(jié)締組織成份區(qū)別明顯的棕黃染色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。記錄5個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均數(shù)作為該病例的MVD值[5]。

1.4 染色結(jié)果評(píng)定 NRP-1、2以腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽(yáng)性結(jié)果，采用細(xì)胞陽(yáng)性百分率和細(xì)胞染色強(qiáng)度得分之和進(jìn)行其表達(dá)的評(píng)定[6-7]。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野（×400）。（1）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5％為0分，5％～為1分，25％～為2分，＞50％為3分。（2）無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～4分為中等陽(yáng)性（++），5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以例（％）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用Dunnett’s T3法。NRP-1、2的表達(dá)評(píng)分和MVD值的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織中NRP-1、2的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NRP-1、NRP-2在大腸癌組織中可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜，亦可分別表達(dá)于組織中動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（不定義為陽(yáng)性結(jié)果），呈淡黃至棕黃色顆粒狀，見圖1。66例大腸癌組織中NRP-1陽(yáng)性表達(dá)者為47例（71.2％），癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)者為17例（25.8％），正常組織為0例。癌組織中NRP-2陽(yáng)性表達(dá)者為53例（80.3％）；癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)者為10例（15.2％），正常組織為0例，NRP-1、2在癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于其癌旁組織及正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為78.452和110.768，均P＜0.01）。不同年齡、性別、腫瘤的部位及分化程度的患者NRP-1、2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤＞5 cm的患者NRP-1陽(yáng)性表達(dá)率較高，腫瘤侵及漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NRP-1、2的陽(yáng)性表達(dá)率均較高，Dukes分期高的患者NRP-1、2陽(yáng)性表達(dá)增加,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

2.2 MVD計(jì)數(shù)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)CD105的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)大腸癌組織的MVD值，66例患者大腸癌組織中MVD值為35.682±5.542，明顯高于癌旁組織的 14.485±3.301和正常組織的6.864±1.771(F=986.654，P＜0.05)。大腸癌患者不同性別、年齡及腫瘤大小、部位、組織分化程度MVD的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而浸潤(rùn)到漿膜及以外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期高的患者相關(guān)MVD的表達(dá)增加(P＜0.01)，NRP-1陽(yáng)性表達(dá)的大腸癌組織MVD值為36.872±5.648，高于NRP-1陰性表達(dá)的32.737±4.067，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.897，P＜0.05）。NRP-2陽(yáng)性表達(dá)的大腸癌組織MVD值為36.396±5.134，高于NRP-2陰性表達(dá)的32.796± 6.379，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.174，P＜0.05）,見表1、圖2。

2.3 MVD計(jì)數(shù)與NRP-1、NRP-2表達(dá)間的相關(guān)性分析 大腸癌組織中NRP-1的表達(dá)評(píng)分與MVD值呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.599，P＜0.01），NRP-2的表達(dá)評(píng)分與MVD值呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.484，P＜0.01），NRP-1、NRP-2均與大腸癌組織血管新生有關(guān)。

Tab.1 Expression of NRP-1,2 in colorectal cancer tissue and correlation of MVD value with its the clinical features and pathological parameters表1 大腸癌組織NRP-1、2的陽(yáng)性表達(dá)及MVD值與臨床特征和病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

目前認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均依賴于腫瘤組織新生血管的形成，為腫瘤的生長(zhǎng)提供所需的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，亦是腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要因素。本文主要從蛋白表達(dá)水平探討NRP-1、NRP-2與大腸癌組織新生血管及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示大腸癌組織中，NRP-1、NRP-2的蛋白表達(dá)水平隨著MVD值的升高而增加，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，并且NRP-1、NRP-2的表達(dá)與大腸癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關(guān)，因此，NRPs與大腸癌組織血管新生密切相關(guān)，還可促進(jìn)癌組織的侵襲及轉(zhuǎn)移。

NRPs是一種多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可與VEGF相互作用既可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，又可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。最初認(rèn)為NRPs只表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞，近來發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞[8]、胰腺癌細(xì)胞[9]中也有NRPs的表達(dá)。NRP-1和NRP-2在肺癌患者中過表達(dá)。NRP-1的過表達(dá)可促使內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖及轉(zhuǎn)移，誘使腫瘤血管的增殖，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、遷徙及腫瘤血管的生成起促進(jìn)作用。NRP-2也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Xu等[10]發(fā)現(xiàn)肝癌小鼠肝癌細(xì)胞NRP-1的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)，提示NRP-1與腫瘤血管生成有關(guān)，而抑制NRP-1的表達(dá)可以抑制體內(nèi)外肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1、NRP-2的表達(dá)程度與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[11-12]。因此，可針對(duì)NRPs的表達(dá)對(duì)大腸癌患者進(jìn)行治療。Dhar等[13]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的血小板生成因子(PDGF-B)-NRP-1信號(hào)系統(tǒng)可以通過骨髓間充質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管的新生以及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此可以針對(duì)NRP-1進(jìn)行腫瘤抗血管靶向治療。近來有研究發(fā)現(xiàn)，NRP-2也與MVD值密切相關(guān)，可促進(jìn)惡性黑色素瘤的血管新生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[14]。NRP-2還可增加血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，在腫瘤生長(zhǎng)方面起重要作用。鑒于NRP-2在腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)方面的作用，針對(duì)NRP-2可提供一個(gè)潛在的新方法去抑制胃腸道轉(zhuǎn)移癌患者癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[15]。Stanton等[16]研究發(fā)現(xiàn)NRP-2也可成為癌癥治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，NRP-1和NRP-2的過表達(dá)與大腸癌的發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NRP-1和NRP-2的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)關(guān)系，提示NRPs可能參與了腫瘤血管的新生。近年來，NRP-1、NRP-2已成為抗腫瘤血管形成方法治療腫瘤的重要靶點(diǎn)，但患者是否從此類制劑中獲益，及此療法的有效性還有待于進(jìn)一步研究。

Fig.1 Expression of NRP-1 and NRP-2 in colorectal carcinoma,paraneoplastic tissues and normal tissues(×400)圖1 NRP-1和NRP-2在大腸癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)（×400）

Fig.2 Expression of CD105 in NRP-1,2 positive and NRP-1,2 negative colorectal carcinoma(×200)圖2 NRP-1、2陽(yáng)性和NRP-1、2陰性大腸癌組織中CD105的表達(dá)（×200）

[1]Park JJ,Cheon JH,Kwon JE,et al.Clinical outcomes and factors related to respectability and curability of EMR for early colorectal cancer[J].Gastrointest Endosc,2011,74(6):1337-1346.doi:10. 1016∕j.gie.2011.07.069.

[2]Parker MW,Xu P,Guo HF,et al.Mechanism of selective VEGF-A binding by neuropilin-1 reveals a basis for specific ligand inhibition [J]. Plos One, 2012, 7(11):49177.doi:10.1371∕journal. pone.0049177.

[3]Yasuoka H,Kodama R,Hirokawa M,et al.Neuropilin-2 expression in papillary thyroid carcinoma:correlation with VEGF-D expression,lymph node metastasis,and VEGF-D-induced aggressive cancer cell phenotype[J].J Clin Endocrinal Metab,2011,96(11):1857-1861.doi:10.1210∕jc.2011-1180.

[4] Xu WG,Yang XQ,Hao SZ,et al.The expression of neuropilin-1 and its correlation with angiogenesis in colorectal cancer[J]Chinese Clinical Oncology,2009,14(1):29-33.[徐衛(wèi)國(guó)，楊小青，郝世柱，等.大腸癌組織中Neuropilin-1的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的相關(guān)性研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2009,14(1):29-33.]

[5]Jankowska P,Malinska A,Nowicki M,et al.Evaluation of cardiac muscle microvessel density in children diagnosed with cyanotic heart defects[J].Folia Histochem Cytobiol,2013,51(4):278-285. doi:10.5603∕FHC.2013.0038.

[6]Li M,Peng B,Tan S,et al.The relationship between expression of NRP-1、VEGF-C and lymph node metastasis of mesorectum in rectal cancer[J].Chinese Journal of Gerontology,2010,30(24):3659-3662.[黎明，彭勃，談順,等.直腸癌NRP-1、VEGF-C的表達(dá)與直腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2010,30(24): 3659-3662.]

[7]Zhou Q,Liang HJ,Yan XC,et al.The relationship of neuropilin-2 expression with lymphangiogenesis in colorectal carcinoma[J].Chinese Clinical Oncology,2009,14(14):797-802.[周琪，梁后杰，閻曉初,等.結(jié)腸癌組織中NRP-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].臨床腫瘤雜志,2009,14(9):797-802.]

[8]Staton CA,Shaw LA,Valluru M，et al.Expression of class 3 semaphorins and their receptors in human breast neoplasia[J].Histopathology,2011,59(2):274-282.doi:10.1111∕j.1365-2559.2011. 03922.x.

[9]Wild JR,Staton CA,Chapple K,et al.Neuropilins:expression and roles in the epithelium[J].Int J Exp Pathol,2012,93(2):81-103. doi:10.1111∕j.1365-2613.2012.00810.x.

[10]Xu J,Xia J.NRP-1 silencing suppresses hepatocellular carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J].Exp Ther Med,2013,5(1):150-154.

[11]Xu WG,Wang YP,Sun H,et al.A research of the expression of NRP-2 and NRP-1 in human colorectal carcinoma and its correlation with the lymph node metastasis of tumor[J].Chongqing Yixue, 2013,42(4):382-387.[徐衛(wèi)國(guó)，王宇鵬，孫紅，等.大腸癌組織中NRP-2、NRP-1的表達(dá)及其與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013,42(4):382-387.]doi:10.3969∕j.issn.1671-8348.2013.04.008.

[12]Xu WG,Wang YP,Guo ZY,et al.Expression of neuropilin 2 in human colorectal carcinoma and its correlation with lymphangiogenesis and lymphatic metastasis of tumor[J].Natl Med J China,2012,92(46): 3274-3278.[徐衛(wèi)國(guó),王宇鵬,郭志義,等.大腸癌組織中NRP-2的表達(dá)及其與腫瘤淋巴管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J].中華醫(yī)學(xué)雜 志,2012,92(46):3274-3278.]doi:10.3760∕cma.j.issn.0376-2491.2012.46.010.

[13]Dhar K,Dhar G,Majumder M,et al.Tumor cell-derived PDGF-B potentiates mouse mesenchymal stem cells-pericytes transition and recruitment through an interaction with NRP-1[J].Mol Cancer,2010, 9:209-221.doi:10.1186∕1476-4598-9-209.

[14]Rushing EC,Stine MJ,Hahn SJ,et al.Neuropilin-2:a novel biomarker for malignant melanoma[J]?Hum Pathol,2012,43(3):381-389.doi:10.1016∕j.humpath.2011.05.008.

[15]Samuel S,Gaur F,Fan F,et al.Neuropilin-2 mediated β-catenin signaling and survival in human gastro-intestinal cancer cell lines [J].PLoS One,2011,6(10):e23208.doi:10.1371∕journal.pone.002 3208.

[16]Stanton MJ,Dutta S,Zhang H,et al.Autophagy control by the VEGF-C∕NRP-2 axis in cancer and its implication for treatment resistance[J].Cancer Res,2013,73(1):160-171.doi:10.1158∕0008-54 72.CAN-11-3635.

（2013-12-16收稿 2014-06-02修回）

（本文編輯 魏杰）

Expression and Clinical Significance of Neuropilin-1 and 2 in Colorectal Carcinoma

XU Weiguo1，MIAO Na1,SUN Hong2,LIU Yun1,ZHANG Shiwei1,HAO Xiaohui3
1Department of Surgical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan 063000,China；2Department of Pathology,School of Basci Medicine,Hebei Union University,3Experimental Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo observe the expression of Neuropilin(NRP)-1,2,to calculate micro vessel density(MVD) in colorectal cancer,paraneoplastic tissues,normal tissues,and to investigate the correlation between NRP-1,2 and MVD to understand the role of NRP-1,2 in the process of tumor angiogenesis.MethodsExpression of NRP-1 and NRP-2 were studied by immunohistochemistry in 66 specimens from colorectal cancer,paraneoplastic tissues and normal tissues.MVD was assessed based on CD105 immunohistochical staining.Results(1)The positive expression of NRP-1,2 in colorectal cancer,paraneoplastic tissues,normal tissues were 71.2％,25.8％,0;80.3％,15.2％,0 respectively.There was a statistical difference between them(P＜0.05).(2)The quantity of MVD in colorectal cancer,paraneoplastic tissues and normal tissues were 35.682±5.542,14.485±3.301 and 6.864±1.771 respectively.There was a statistical difference between them(P＜0.05). (3)Expression of NRP-1,2 had a good correlation with the tumor size,infiltrating depth,lymph node metastasis,Dukes staging(P＜0.05),but no correlation was found with the tumor position,histological types,differentiation degree and the gender or age of patients(P＞0.05).(4)The MVD value had no correlation with the gender or age of patients,tumor size,position, histological types(P＞0.05),but had a good correlation with infiltrating depth,lymphatic metastasis and Dukes staging(P＜0.05).(5)There was a positive correlation between NRP-1,2 and MVD value(P＜0.01).ConclusionNRP-1,2 may play an important role in the angiogenesis of the colorectal cancer,and it correlates with the invasion and metastasis of colorectal cancer closely.

colorectal neoplasms;neuropilins;immunohistochemistry;colorectal cancer;micro vessel density；tumor angiogenesis;vascular endothelial cell

R735.3+4

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.011

河北省科技廳資助項(xiàng)目（10276115D）

1河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科（郵編063000）；2河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系;3河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心