劉 濤 王玉亮 宋紅麗 付楠楠 吳本娟 沈中陽△

細胞與分子生物學

表達microRNA-203 tough decoy的慢病毒載體構建及應用

劉 濤1，2王玉亮1宋紅麗2付楠楠3吳本娟3沈中陽2△

目的 建立表達microRNA（miRNA）tough decoy（TuD）的慢病毒載體構建方法，并檢測其對細胞內(nèi)miRNA表達水平及細胞表型的影響。方法在慢病毒表達質(zhì)粒pSIH1-H1-copGFP中通過兩步克隆，首先構建miRNA TuD通用骨架質(zhì)粒，進一步構建特異性針對大鼠miR-203的TuD表達載體。在293T細胞中包裝成慢病毒后，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs），同時用pSIH1-H1-copGFP空質(zhì)粒包裝慢病毒，感染BM-MSCs作為對照。定量RT-PCR檢測細胞中miR-203的水平變化，并用CCK-8法和Annexin V-PI雙標記法分別檢測BMMSCs的活性和凋亡。結果成功構建了基于pSIH1-H1-copGFP質(zhì)粒的miR-203 TuD表達載體，并對其序列進行了驗證。用表達miR-203 TuD的重組慢病毒感染BM-MSCs后第3、6、9天檢測細胞內(nèi)源性miR-203表達水平降低，同時細胞活性增高，凋亡比例降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。結論兩步克隆法構建miRNA TuD表達載體是一種簡便高效的方法，其表達產(chǎn)物能夠有效抑制細胞內(nèi)源性miRNA水平，同時影響細胞表型。

間質(zhì)干細胞；慢病毒屬；遺傳載體；質(zhì)粒；細胞凋亡；微RNAs；細胞活性；miRNA-203 tough decoy

微RNA（microRNA，miRNA）是一類細胞內(nèi)源性生成的、18～25個核苷酸長度的非編碼RNA家族，與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）結合，對靶基因的表達進行轉(zhuǎn)錄后水平的負性調(diào)控，是重要的細胞內(nèi)源性基因表達調(diào)控因子[1]。在miRNA功能研究中，常需要將細胞內(nèi)miRNA的水平降低。目前應用較多的方法是針對目的miRNA設計反向互補核苷酸序列，使其靶向結合目的miRNA，阻止miRNA發(fā)揮對靶基因的抑制作用。但這些方法對miRNA抑制作用維持的時間較短且不穩(wěn)定。近年來，一種名為miRNA tough decoy （TuD）[2]的技術較好地解決了這一問題，特別是經(jīng)Haraguchi等[3]改進后的miRNA TuD分子結構，明顯優(yōu)化了對miRNA的抑制效果。但在實際應用中，由于miRNA TuD分子結構較為復雜，并且大多數(shù)識別RNA聚合酶Ⅲ的真核表達載體僅提供2個限制性內(nèi)切酶位點用于克隆，這使得表達miRNA TuD的質(zhì)粒載體構建過程較困難。為簡化過程，本研究探索了一種基于重組慢病毒載體pSIH1-H1-copGFP的miRNA TuD表達載體構建方式，并用這一方法構建針對大鼠miR-203的miRNA TuD表達載體，并檢測miR-203 TuD對miR-203的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料 寡核苷酸鏈由北京天潤奧科生物科技有限公司合成，所用的寡核苷酸序列見表1。清潔級Wistar大鼠，雌雄不拘，100～120 g，購于解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。System Biosciences公司的慢病毒表達質(zhì)粒pSIH1-H1-copGFP及3種包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G由本實驗室保存。293T細胞由本實驗室保存。胎牛血清（PAA公司），HyClone DMEM及DMEM-F12培養(yǎng)液、T4 DNA連接酶和Taq DNA聚合酶（Thermo公司），限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptII cDNA第一鏈合成試劑盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Alexa Fluor 488 Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司），感染增強劑Polybrene（Sigma-aldrich公司），CCK-8細胞活性檢測試劑（Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）的提取和鑒定 按照本實驗室前期建立的方法進行[4]。

1.2.2 pSIH1∕TuD骨架質(zhì)粒的構建和鑒定 將合成的2條寡核苷酸TuD-Top和TuD-Bottom退火形成雙鏈DNA，克隆插入慢病毒表達載體pSIH1-H1-copGFP的BamHⅠ和EcoRⅠ中。重組質(zhì)粒用XbaⅠ單酶切，若出現(xiàn)1.75 kb左右的片段，表明重組子正確。重組正確的質(zhì)粒命名為pSIH1∕TuD。

1.2.3 miR-203 TuD表達質(zhì)粒pSIH1∕TuD203的構建和鑒定 將2條寡核苷酸TuD203-Top和TuD203-Bottom退火成雙鏈DNA。將pSIH1∕TuD質(zhì)粒用BamHⅠ單酶切后，與退火形成的雙鏈DNA連接。以重組質(zhì)粒為模板，F(xiàn)wdH和RvsH（表1）為引物進行PCR，產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，若產(chǎn)物為233 bp，則片段連接成功。重組正確的質(zhì)粒經(jīng)測序確定后，命名為pSIH1∕TuD203。

Tab.1 Sequence of the oligonucleotides and primers used in this study表1 寡核苷酸及引物序列

1.2.4 表達miR-203 TuD的重組慢病毒包裝和感染大鼠BM-MSCs 將pSIH1∕TuD203慢病毒表達質(zhì)粒及3種包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G按摩爾比1∶3∶1∶1的比例用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后離心收集細胞上清，即得到表達miR-203 TuD的慢病毒產(chǎn)物。同時用pSIH1-H1-copGFP空質(zhì)粒與上述3種包裝質(zhì)粒進行慢病毒包裝，作對照組。提取Wistar大鼠的BM-MSCs，按照感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=5的比例感染BMMSCs，分別于感染后第3、6、9天時收集細胞，提取總RNA，檢測miR-203 TuD組及對照組中miR-203的表達水平。

1.2.5 BM-MSCs中miR-203表達水平的檢測 提取BMMSCs的總RNA，RT-PCR方法檢測miRNA水平。(1)分別以203-RT和U6-RT為引物，對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。(2)以cDNA為模板，用特異性上游引物203-Fwd或U6-Fwd以及通用下游引物Reverse（表1）分別對目的基因miR-203及內(nèi)參基因U6 snRNA進行擴增，反應體系按照SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒說明進行，用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)進行檢測。采用相對定量方法進行miRNA水平分析，miR-203表達水平用2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiR-203-CtU6。將對照組的miR-203表達水平設為1，計算實驗組miR-203的相對表達水平。

1.2.6 BM-MSCs細胞活性檢測 在96孔細胞培養(yǎng)板中接種BM-MSCs，并進行慢病毒感染。分別于感染后第3、6、9天時，在相應的孔中加入每孔10 μL的CCK-8細胞活性檢測試劑。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標儀測定各孔在450 nm波長的吸光度（A450）值，以A450的大小評估細胞活性。

1.2.7 BM-MSCs細胞凋亡檢測 將慢病毒感染后的BMMSCs消化成細胞懸液，按照Alexa Fluor 488 Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒說明的步驟，用熒光標記的Annexin V和PI與細胞孵育，流式細胞術檢測細胞熒光標記的情況，以Annexin V陽性且PI染色陰性的細胞作為凋亡細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計圖制作。每個時間點的兩組間檢測指標的比較用Student’s t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pSIH1∕TuD203重組質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)電泳鑒定，pSIH1∕TuD203重組質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物大小為233 bp，與預期相符，見圖1。進一步DNA測序表明序列完全正確。

Fig.1 PCR and electrophoresis identification of the pSIH1∕TuD203 plasmid圖1 pSIH1∕TuD203質(zhì)粒的PCR電泳鑒定

2.2 TuD203對BM-MSCs內(nèi)源性miR-203的抑制作用 miR-203 TuD的慢病毒感染大鼠BM-MSCs后第3、6和9天時，miR-203的表達水平均被明顯抑制，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。表明該方法構建的miR-203 TuD表達載體能夠在感染后較長時間內(nèi)有效抑制細胞內(nèi)miR-203的水平。

Fig.2 Suppression of miR-203 TuD on endogenous miR-203 of BM-MSCs圖2 miR-203 TuD對BM-MSCs內(nèi)源性miR-203水平的抑制作用

2.3 miR-203 TuD對BM-MSCs生存能力的影響 用表達miR-203 TuD的慢病毒載體感染BMMSCs，感染后第3、6、9天時細胞活性較對照組明顯增強，見圖3。而在感染后第3天和6天時miR-203 TuD組細胞凋亡水平無顯著變化，感染后第9天時，miR-203 TuD組細胞凋亡水平明顯降低，見圖4。表明miR-203在BM-MSCs中起到抑制細胞活性和促進細胞凋亡的作用，封閉miR-203后，BM-MSCs的生存能力提高。

Fig.3 Effect of miR-203 TuD on BM-MSCs viability圖3 miR-203 TuD對BM-MSCs細胞活性的影響

Fig.4 Effect of miR-203 TuD on BM-MSCs apoptosis圖4 miR-203 TuD對BM-MSCs細胞凋亡的影響

3 討論

3.1 miRNA TuD對miR-203水平的抑制 隨著miRNA研究的不斷深入，對其表達水平的干預方法也在改進，其中Haraguchi等[3]報道了一種具有特定結構的miRNA TuD，能夠與目的miRNA特異性結合，在較長時間內(nèi)對目的miRNA的水平起到穩(wěn)定的抑制作用。本文按照miRNA TuD的結構，成功構建了大鼠miR-203 TuD表達載體，并包裝生成慢病毒，感染大鼠BM-MSCs。由于miRNA TuD與其他miRNA抑制劑如鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）形式的miRNA反義核酸類似，都是基于反向互補序列與miRNA發(fā)生穩(wěn)定結合的作用機制，這種情況下，miRNA的抑制可被定量RT-PCR方法所檢測到[2]。結果顯示，基于重組慢病毒的miR-203 TuD表達載體能夠?qū)Υ笫驜M-MSCs的內(nèi)源性miR-203進行明顯和有效的抑制作用。

3.2 miR-203 TuD增強BM-MSCs的生存能力 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的具有多向分化潛能的成體干細胞[5]，以骨髓中含量最多，即BM-MSCs。由于BM-MSCs表達較低的MHCⅠ類分子，不表達MHCⅡ類分子，這使其能夠免受免疫系統(tǒng)的殺傷。這些優(yōu)點使得BMMSCs在多種疾病的治療方面起到積極的作用[6]。然而，BM-MSCs的缺點主要是其潛在的致瘤風險，包括其本身發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化以及誘導其他細胞發(fā)生惡變[5-7]。另外，BM-MSCs的生存能力有限，也是影響其發(fā)揮療效的因素之一。移植到病灶部位后，大多數(shù)MSCs會在數(shù)小時內(nèi)發(fā)生死亡，大大影響了其對損傷組織支持和保護作用的發(fā)揮。例如，有研究者觀察到，MSCs移植至心肌梗死部位后，其生存能力很低，這導致其對受損心肌細胞的支持和保護作用非常有限[8]。

為克服BM-MSCs的缺點，已有研究應用基因工程的方法，針對其本身特定基因水平進行干預，進而改變細胞的表型，包括增強其生存能力、向損傷部位趨化和定植能力、分化能力，并減低其致瘤風險等[9]。miRNA是廣泛參與基因表達調(diào)控的小分子RNA，本文以miR-203為研究對象，發(fā)現(xiàn)miR-203是一種抑制BM-MSCs生存能力的因子，而應用miR-203 TuD對miR-203的水平進行抑制后，能夠顯著提高BM-MSCs的活性，減輕其凋亡。這些結果表明，通過抑制細胞內(nèi)源性miR-203的水平，能夠使BMMSCs的生存能力提高，并進一步增強其對受損組織和細胞的支持作用。人類miR-203序列與大鼠miR-203完全同源，對人類miR-203的研究表明，其在多種細胞中都具有抑制細胞生長的活性[10-11]。例如，在橫紋肌肉瘤細胞中，miR-203的表達水平由于其啟動子的高度甲基化而被抑制，導致細胞的生長抑制作用減輕，促進腫瘤發(fā)生[10]。在U251人膠質(zhì)瘤細胞中，miR-203能夠通過靶定磷脂酶D2（phospholipase D2，PLD2）抑制細胞的增殖和侵襲能力[11]。這些事實從另一方面提示，需要防止可能由于miR-203過度抑制而引發(fā)的細胞增殖過度和惡性轉(zhuǎn)化。需要注意的是，miR-203被抑制后，細胞活性的增強出現(xiàn)較早且持續(xù)發(fā)生，而在感染miR-203抑制物后第3和6天時，細胞凋亡程度雖有所減輕，但與對照組細胞相比差異無統(tǒng)計學意義，直到第9天時才能檢測到明顯的差異，其具體原因有待進一步探索。解決這些問題需要在后續(xù)研究中對BM-MSCs中miR-203發(fā)揮作用的靶基因進行篩選和驗證，以闡明miR-203對BM-MSCs調(diào)控作用的具體機制。

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（2014-02-23收稿 2014-06-19修回）

（本文編輯 李鵬）

Construction and Application of Lentiviral Vectors Expressing microRNA-203 Tough Decoy

LIU Tao1，2，WANG Yuliang1，SONG Hongli2，F(xiàn)U Nannan3，WU Benjuan3，SHEN Zhongyang2△
1 Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300384，China;2 The Organ Transplant Center，Tianjin First Center Hospital;3 The First Center Clinical College，Tianjin Medical University
△

E-mail:shenzy_2014@163.com

ObjectiveTo establish method of constructing lentiviral vectors to express microRNA（miRNA）''tough decoy''（TuD）and to detect the effects of the TuD on cellular endogenous miRNA level and cellular phenotypes.MethodsTwo-step cloning strategy was utilized to first generate a universal miRNA TuD frame vector，followed by constructing the TuD expression vector specially targeting miR-203.The package of the recombinant lentivirus was performed in 293T cells.Then the rat bone marrow mesenchymal stem cells（BM-MSCs）were infected by the miR-203 TuD expression lentivirus.The pSIH1-H1-copGFP vector was also packaged and the BM-MSCs infected by this lentivirus were served as control.Endogenous miR-203 level in BM-MSCs was measured by quantitative RT-PCR，and cellular viability and apoptosis were detected by CCK-8 test and Annexin V-PI staining respectively.ResultsThe miR-203 TuD expression vector was successfully constructed and inserted sequence was validated.At the 3rd，6th and 9th days after infected by the miR-203 TuD expression lentivirus，rat BM-MSCs exhibited a repressed endogenous miR-203 level.The miR-203 TuD also promoted viability and inhibited apoptosis of BM-MSCs.All these differences between miR-203 TuD group and control group were statistically significant.ConclusionThe two-step cloning method for the construction of miRNA TuD expression vector is simple and efficient.The miRNA TuD can effectively suppress the level of the target miRNA and affect cellular phenotypes.

mesenchymal stem cells；lentivirus；genetic vectors；plasmids；apoptosis；microRNAs；cellular viability；miRNA-203 tough decoy

Q78

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.001

國家自然科學基金資助項目（81270528）；中國博士后科學基金資助項目（2013M541185）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目（08JCYBJC08400、12JCZDJC25200、11JCZDJC27800）

1天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室（郵編300384），2器官移植中心；3天津醫(yī)科大學一中心臨床學院

△通訊作者 E-mail：shenzy_2014@163.com