劉 濤 王玉亮 宋紅麗 付楠楠 吳本娟 沈中陽△

細(xì)胞與分子生物學(xué)

表達(dá)microRNA-203 tough decoy的慢病毒載體構(gòu)建及應(yīng)用

劉 濤1，2王玉亮1宋紅麗2付楠楠3吳本娟3沈中陽2△

目的 建立表達(dá)microRNA（miRNA）tough decoy（TuD）的慢病毒載體構(gòu)建方法，并檢測其對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)水平及細(xì)胞表型的影響。方法在慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pSIH1-H1-copGFP中通過兩步克隆，首先構(gòu)建miRNA TuD通用骨架質(zhì)粒，進(jìn)一步構(gòu)建特異性針對(duì)大鼠miR-203的TuD表達(dá)載體。在293T細(xì)胞中包裝成慢病毒后，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs），同時(shí)用pSIH1-H1-copGFP空質(zhì)粒包裝慢病毒，感染BM-MSCs作為對(duì)照。定量RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-203的水平變化，并用CCK-8法和Annexin V-PI雙標(biāo)記法分別檢測BMMSCs的活性和凋亡。結(jié)果成功構(gòu)建了基于pSIH1-H1-copGFP質(zhì)粒的miR-203 TuD表達(dá)載體，并對(duì)其序列進(jìn)行了驗(yàn)證。用表達(dá)miR-203 TuD的重組慢病毒感染BM-MSCs后第3、6、9天檢測細(xì)胞內(nèi)源性miR-203表達(dá)水平降低，同時(shí)細(xì)胞活性增高，凋亡比例降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論兩步克隆法構(gòu)建miRNA TuD表達(dá)載體是一種簡便高效的方法，其表達(dá)產(chǎn)物能夠有效抑制細(xì)胞內(nèi)源性miRNA水平，同時(shí)影響細(xì)胞表型。

間質(zhì)干細(xì)胞；慢病毒屬；遺傳載體；質(zhì)粒；細(xì)胞凋亡；微RNAs；細(xì)胞活性；miRNA-203 tough decoy

微RNA（microRNA，miRNA）是一類細(xì)胞內(nèi)源性生成的、18～25個(gè)核苷酸長度的非編碼RNA家族，與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）結(jié)合，對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)性調(diào)控，是重要的細(xì)胞內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)控因子[1]。在miRNA功能研究中，常需要將細(xì)胞內(nèi)miRNA的水平降低。目前應(yīng)用較多的方法是針對(duì)目的miRNA設(shè)計(jì)反向互補(bǔ)核苷酸序列，使其靶向結(jié)合目的miRNA，阻止miRNA發(fā)揮對(duì)靶基因的抑制作用。但這些方法對(duì)miRNA抑制作用維持的時(shí)間較短且不穩(wěn)定。近年來，一種名為miRNA tough decoy （TuD）[2]的技術(shù)較好地解決了這一問題，特別是經(jīng)Haraguchi等[3]改進(jìn)后的miRNA TuD分子結(jié)構(gòu)，明顯優(yōu)化了對(duì)miRNA的抑制效果。但在實(shí)際應(yīng)用中，由于miRNA TuD分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，并且大多數(shù)識(shí)別RNA聚合酶Ⅲ的真核表達(dá)載體僅提供2個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用于克隆，這使得表達(dá)miRNA TuD的質(zhì)粒載體構(gòu)建過程較困難。為簡化過程，本研究探索了一種基于重組慢病毒載體pSIH1-H1-copGFP的miRNA TuD表達(dá)載體構(gòu)建方式，并用這一方法構(gòu)建針對(duì)大鼠miR-203的miRNA TuD表達(dá)載體，并檢測miR-203 TuD對(duì)miR-203的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料 寡核苷酸鏈由北京天潤奧科生物科技有限公司合成，所用的寡核苷酸序列見表1。清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄不拘，100～120 g，購于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。System Biosciences公司的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pSIH1-H1-copGFP及3種包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G由本實(shí)驗(yàn)室保存。293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清（PAA公司），HyClone DMEM及DMEM-F12培養(yǎng)液、T4 DNA連接酶和Taq DNA聚合酶（Thermo公司），限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptII cDNA第一鏈合成試劑盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Alexa Fluor 488 Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司），感染增強(qiáng)劑Polybrene（Sigma-aldrich公司），CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑（Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）的提取和鑒定 按照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行[4]。

1.2.2 pSIH1∕TuD骨架質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將合成的2條寡核苷酸TuD-Top和TuD-Bottom退火形成雙鏈DNA，克隆插入慢病毒表達(dá)載體pSIH1-H1-copGFP的BamHⅠ和EcoRⅠ中。重組質(zhì)粒用XbaⅠ單酶切，若出現(xiàn)1.75 kb左右的片段，表明重組子正確。重組正確的質(zhì)粒命名為pSIH1∕TuD。

1.2.3 miR-203 TuD表達(dá)質(zhì)粒pSIH1∕TuD203的構(gòu)建和鑒定 將2條寡核苷酸TuD203-Top和TuD203-Bottom退火成雙鏈DNA。將pSIH1∕TuD質(zhì)粒用BamHⅠ單酶切后，與退火形成的雙鏈DNA連接。以重組質(zhì)粒為模板，F(xiàn)wdH和RvsH（表1）為引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，若產(chǎn)物為233 bp，則片段連接成功。重組正確的質(zhì)粒經(jīng)測序確定后，命名為pSIH1∕TuD203。

Tab.1 Sequence of the oligonucleotides and primers used in this study表1 寡核苷酸及引物序列

1.2.4 表達(dá)miR-203 TuD的重組慢病毒包裝和感染大鼠BM-MSCs 將pSIH1∕TuD203慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及3種包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G按摩爾比1∶3∶1∶1的比例用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后離心收集細(xì)胞上清，即得到表達(dá)miR-203 TuD的慢病毒產(chǎn)物。同時(shí)用pSIH1-H1-copGFP空質(zhì)粒與上述3種包裝質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，作對(duì)照組。提取Wistar大鼠的BM-MSCs，按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=5的比例感染BMMSCs，分別于感染后第3、6、9天時(shí)收集細(xì)胞，提取總RNA，檢測miR-203 TuD組及對(duì)照組中miR-203的表達(dá)水平。

1.2.5 BM-MSCs中miR-203表達(dá)水平的檢測 提取BMMSCs的總RNA，RT-PCR方法檢測miRNA水平。(1)分別以203-RT和U6-RT為引物，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。(2)以cDNA為模板，用特異性上游引物203-Fwd或U6-Fwd以及通用下游引物Reverse（表1）分別對(duì)目的基因miR-203及內(nèi)參基因U6 snRNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行，用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測。采用相對(duì)定量方法進(jìn)行miRNA水平分析，miR-203表達(dá)水平用2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiR-203-CtU6。將對(duì)照組的miR-203表達(dá)水平設(shè)為1，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組miR-203的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 BM-MSCs細(xì)胞活性檢測 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種BM-MSCs，并進(jìn)行慢病毒感染。分別于感染后第3、6、9天時(shí)，在相應(yīng)的孔中加入每孔10 μL的CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長的吸光度（A450）值，以A450的大小評(píng)估細(xì)胞活性。

1.2.7 BM-MSCs細(xì)胞凋亡檢測 將慢病毒感染后的BMMSCs消化成細(xì)胞懸液，按照Alexa Fluor 488 Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明的步驟，用熒光標(biāo)記的Annexin V和PI與細(xì)胞孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞熒光標(biāo)記的情況，以Annexin V陽性且PI染色陰性的細(xì)胞作為凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)圖制作。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的兩組間檢測指標(biāo)的比較用Student’s t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pSIH1∕TuD203重組質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)電泳鑒定，pSIH1∕TuD203重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為233 bp，與預(yù)期相符，見圖1。進(jìn)一步DNA測序表明序列完全正確。

Fig.1 PCR and electrophoresis identification of the pSIH1∕TuD203 plasmid圖1 pSIH1∕TuD203質(zhì)粒的PCR電泳鑒定

2.2 TuD203對(duì)BM-MSCs內(nèi)源性miR-203的抑制作用 miR-203 TuD的慢病毒感染大鼠BM-MSCs后第3、6和9天時(shí)，miR-203的表達(dá)水平均被明顯抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。表明該方法構(gòu)建的miR-203 TuD表達(dá)載體能夠在感染后較長時(shí)間內(nèi)有效抑制細(xì)胞內(nèi)miR-203的水平。

Fig.2 Suppression of miR-203 TuD on endogenous miR-203 of BM-MSCs圖2 miR-203 TuD對(duì)BM-MSCs內(nèi)源性miR-203水平的抑制作用

2.3 miR-203 TuD對(duì)BM-MSCs生存能力的影響 用表達(dá)miR-203 TuD的慢病毒載體感染BMMSCs，感染后第3、6、9天時(shí)細(xì)胞活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，見圖3。而在感染后第3天和6天時(shí)miR-203 TuD組細(xì)胞凋亡水平無顯著變化，感染后第9天時(shí)，miR-203 TuD組細(xì)胞凋亡水平明顯降低，見圖4。表明miR-203在BM-MSCs中起到抑制細(xì)胞活性和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，封閉miR-203后，BM-MSCs的生存能力提高。

Fig.3 Effect of miR-203 TuD on BM-MSCs viability圖3 miR-203 TuD對(duì)BM-MSCs細(xì)胞活性的影響

Fig.4 Effect of miR-203 TuD on BM-MSCs apoptosis圖4 miR-203 TuD對(duì)BM-MSCs細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

3.1 miRNA TuD對(duì)miR-203水平的抑制 隨著miRNA研究的不斷深入，對(duì)其表達(dá)水平的干預(yù)方法也在改進(jìn)，其中Haraguchi等[3]報(bào)道了一種具有特定結(jié)構(gòu)的miRNA TuD，能夠與目的miRNA特異性結(jié)合，在較長時(shí)間內(nèi)對(duì)目的miRNA的水平起到穩(wěn)定的抑制作用。本文按照miRNA TuD的結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建了大鼠miR-203 TuD表達(dá)載體，并包裝生成慢病毒，感染大鼠BM-MSCs。由于miRNA TuD與其他miRNA抑制劑如鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）形式的miRNA反義核酸類似，都是基于反向互補(bǔ)序列與miRNA發(fā)生穩(wěn)定結(jié)合的作用機(jī)制，這種情況下，miRNA的抑制可被定量RT-PCR方法所檢測到[2]。結(jié)果顯示，基于重組慢病毒的miR-203 TuD表達(dá)載體能夠?qū)Υ笫驜M-MSCs的內(nèi)源性miR-203進(jìn)行明顯和有效的抑制作用。

3.2 miR-203 TuD增強(qiáng)BM-MSCs的生存能力 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[5]，以骨髓中含量最多，即BM-MSCs。由于BM-MSCs表達(dá)較低的MHCⅠ類分子，不表達(dá)MHCⅡ類分子，這使其能夠免受免疫系統(tǒng)的殺傷。這些優(yōu)點(diǎn)使得BMMSCs在多種疾病的治療方面起到積極的作用[6]。然而，BM-MSCs的缺點(diǎn)主要是其潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，包括其本身發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化以及誘導(dǎo)其他細(xì)胞發(fā)生惡變[5-7]。另外，BM-MSCs的生存能力有限，也是影響其發(fā)揮療效的因素之一。移植到病灶部位后，大多數(shù)MSCs會(huì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生死亡，大大影響了其對(duì)損傷組織支持和保護(hù)作用的發(fā)揮。例如，有研究者觀察到，MSCs移植至心肌梗死部位后，其生存能力很低，這導(dǎo)致其對(duì)受損心肌細(xì)胞的支持和保護(hù)作用非常有限[8]。

為克服BM-MSCs的缺點(diǎn)，已有研究應(yīng)用基因工程的方法，針對(duì)其本身特定基因水平進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而改變細(xì)胞的表型，包括增強(qiáng)其生存能力、向損傷部位趨化和定植能力、分化能力，并減低其致瘤風(fēng)險(xiǎn)等[9]。miRNA是廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控的小分子RNA，本文以miR-203為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)miR-203是一種抑制BM-MSCs生存能力的因子，而應(yīng)用miR-203 TuD對(duì)miR-203的水平進(jìn)行抑制后，能夠顯著提高BM-MSCs的活性，減輕其凋亡。這些結(jié)果表明，通過抑制細(xì)胞內(nèi)源性miR-203的水平，能夠使BMMSCs的生存能力提高，并進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)受損組織和細(xì)胞的支持作用。人類miR-203序列與大鼠miR-203完全同源，對(duì)人類miR-203的研究表明，其在多種細(xì)胞中都具有抑制細(xì)胞生長的活性[10-11]。例如，在橫紋肌肉瘤細(xì)胞中，miR-203的表達(dá)水平由于其啟動(dòng)子的高度甲基化而被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制作用減輕，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[10]。在U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-203能夠通過靶定磷脂酶D2（phospholipase D2，PLD2）抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力[11]。這些事實(shí)從另一方面提示，需要防止可能由于miR-203過度抑制而引發(fā)的細(xì)胞增殖過度和惡性轉(zhuǎn)化。需要注意的是，miR-203被抑制后，細(xì)胞活性的增強(qiáng)出現(xiàn)較早且持續(xù)發(fā)生，而在感染miR-203抑制物后第3和6天時(shí)，細(xì)胞凋亡程度雖有所減輕，但與對(duì)照組細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，直到第9天時(shí)才能檢測到明顯的差異，其具體原因有待進(jìn)一步探索。解決這些問題需要在后續(xù)研究中對(duì)BM-MSCs中miR-203發(fā)揮作用的靶基因進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，以闡明miR-203對(duì)BM-MSCs調(diào)控作用的具體機(jī)制。

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（2014-02-23收稿 2014-06-19修回）

（本文編輯 李鵬）

Construction and Application of Lentiviral Vectors Expressing microRNA-203 Tough Decoy

LIU Tao1，2，WANG Yuliang1，SONG Hongli2，F(xiàn)U Nannan3，WU Benjuan3，SHEN Zhongyang2△
1 Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300384，China;2 The Organ Transplant Center，Tianjin First Center Hospital;3 The First Center Clinical College，Tianjin Medical University
△

E-mail:shenzy_2014@163.com

ObjectiveTo establish method of constructing lentiviral vectors to express microRNA（miRNA）''tough decoy''（TuD）and to detect the effects of the TuD on cellular endogenous miRNA level and cellular phenotypes.MethodsTwo-step cloning strategy was utilized to first generate a universal miRNA TuD frame vector，followed by constructing the TuD expression vector specially targeting miR-203.The package of the recombinant lentivirus was performed in 293T cells.Then the rat bone marrow mesenchymal stem cells（BM-MSCs）were infected by the miR-203 TuD expression lentivirus.The pSIH1-H1-copGFP vector was also packaged and the BM-MSCs infected by this lentivirus were served as control.Endogenous miR-203 level in BM-MSCs was measured by quantitative RT-PCR，and cellular viability and apoptosis were detected by CCK-8 test and Annexin V-PI staining respectively.ResultsThe miR-203 TuD expression vector was successfully constructed and inserted sequence was validated.At the 3rd，6th and 9th days after infected by the miR-203 TuD expression lentivirus，rat BM-MSCs exhibited a repressed endogenous miR-203 level.The miR-203 TuD also promoted viability and inhibited apoptosis of BM-MSCs.All these differences between miR-203 TuD group and control group were statistically significant.ConclusionThe two-step cloning method for the construction of miRNA TuD expression vector is simple and efficient.The miRNA TuD can effectively suppress the level of the target miRNA and affect cellular phenotypes.

mesenchymal stem cells；lentivirus；genetic vectors；plasmids；apoptosis；microRNAs；cellular viability；miRNA-203 tough decoy

Q78

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270528）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013M541185）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（08JCYBJC08400、12JCZDJC25200、11JCZDJC27800）

1天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300384），2器官移植中心；3天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院

△通訊作者 E-mail：shenzy_2014@163.com