陸立仁 張良清 盧 燕

異丙酚對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞TREM-1表達(dá)的影響

陸立仁1張良清2△盧 燕2

目的 探討異丙酚對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體-1（TREM-1）表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，分成7組，分別對(duì)應(yīng)：Control組，單純無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；內(nèi)毒素（LPS）組，單純LPS 100 μg/L刺激；Pro組，單純加入異丙酚100 μmol/L；P1組，LPS+異丙酚12.5 μmol/L；P2組，LPS+異丙酚25 μmol/L；P3組，LPS+異丙酚50 μmol/L；P4組，LPS+異丙酚100 μmol/L。觀察16 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用ELISA測(cè)定腫瘤壞死因子（TNF）-α水平；收集細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TREM-1蛋白表達(dá)水平；收集細(xì)胞采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TREM-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與LPS組相比，P3組與P4組的細(xì)胞表面TREM-1蛋白表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05），細(xì)胞上清液中TNF-α水平明顯下降（P＜0.05）；與Control組比較，LPS組TREM-1 mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與LPS組比較，P4組細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論異丙酚可使LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表面TREM-1蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞TNF-α的釋放減少，TREM-1 mRNA的表達(dá)量下降。

內(nèi)毒素類；脂多糖類；二異丙酚；單核細(xì)胞；腫瘤壞死因子α；髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1

膿毒癥是由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），有細(xì)菌或可疑感染灶存在，是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)過度或炎癥失控所致。髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體-1 （TREM-1）是近年發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于髓樣細(xì)胞的免疫球蛋白超家族活化受體，可與內(nèi)毒素（LPS）協(xié)同誘導(dǎo)單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1的分泌[1]。近年來逐步證實(shí)TREM-1可能觸發(fā)并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，是介導(dǎo)膿毒性休克的關(guān)鍵介質(zhì)，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[2]。異丙酚是一種新型非巴比妥類靜脈麻醉藥，具有良好的抗氧化作用和抑制細(xì)胞因子合成與釋放的功能，它以誘導(dǎo)蘇醒迅速，對(duì)心肺功能影響小而在臨床上應(yīng)用廣泛。本研究通過觀察異丙酚的濃度變化對(duì)細(xì)胞TREM-1蛋白、mRNA表達(dá)以及促炎因子水平的影響，以期探討異丙酚抑制炎性反應(yīng)的位點(diǎn)及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核細(xì)胞系THP-1由南方醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室惠贈(zèng)。LPS from E.coli 055:B5(L 2880)購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；人TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒、Human TREM-1 Phycoerythrin MAb(FAB1278P)、Mouse IgG1 Phycoerythrin Isotype Control（IC002P）均購自美國R＆D公司；PrimeScript RT reagent kit、Sybr primescript RT-PCR kit購自日本TaKaRa公司；引物由廣州Invitrogen公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，行臺(tái)盼藍(lán)染色后證實(shí)存活率達(dá)到95％以上。離心收集THP-1細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次后，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到2.4×106/mL，向每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜。選取24孔培養(yǎng)板分成7組，分別對(duì)應(yīng)：Control組，單純無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；LPS組，單純LPS 100 μg/L刺激；Pro組，單純加入異丙酚100 μmol/L；P1組，LPS+異丙酚12.5 μmol/L；P2組，LPS+異丙酚25 μmol/L；P3組，LPS+異丙酚50 μmol/L；P4組，LPS+異丙酚100 μmol/L。觀察規(guī)定的時(shí)間后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液-70℃保存，采用ELISA檢測(cè)TNF-α水平；收集細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測(cè)TREM-1蛋白表達(dá)水平；收集細(xì)胞采用實(shí)時(shí)定量PCR （qRT-PCR）檢測(cè)TREM-1 mRNA表達(dá)水平。

1.3 FACS檢測(cè)細(xì)胞表面TREM-1蛋白 收集細(xì)胞后離心1 500 r/min，5 min，Staining Buffer洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為4× 106/mL。其中1管加入PE標(biāo)記的大鼠IgG2A抗體作為同型對(duì)照，其余加入PE標(biāo)記的human anti-TREM-1，2～8℃溫度下孵育30～45 min，Staining Buffer洗滌2次后送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)定TREM-1 mRNA 引物設(shè)計(jì)參照Gen-Bank中的序列，由廣州Invitrogen生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，TREM-1引物上游5′-CTGAAATCAACCTTACAAATGTGAC-3′，下游5′-GCTCTTACTCAGGAATCCACCA-3′，擴(kuò)增長度92 bp；內(nèi)參GAPDH引物上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，擴(kuò)增長度93 bp。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA時(shí)嚴(yán)格按照TaKaRa公司的PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照TaKaRa公司的SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒操作說明進(jìn)行；反應(yīng)條件為：95℃5 min，95℃30 s，62℃15 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)，72℃10 min。采用Corbett公司Rotor gene 3000分析系統(tǒng)，通過比較CT值法(2-ΔΔCT法)比較TREM-1相對(duì)與GAPDH持家基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ELISA測(cè)定上清液中TNF-α水平 將細(xì)胞培養(yǎng)上清液從-70℃冰箱取出后室溫下解凍，然后按照人TNF-α ELISA試劑盒操作說明測(cè)定上清液中TNF-α水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理組TREM-1蛋白表達(dá)水平 與Control組相比，單純LPS處理后，LPS組細(xì)胞表面TREM-1蛋白水平明顯下降（P＜0.05），單純異丙酚處理后，Pro組細(xì)胞表面TREM-1蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）。與LPS組相比，異丙酚與LPS共孵育處理下，P1組、P2組細(xì)胞表面TREM-1蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05），P3組、P4組的細(xì)胞表面TREM-1蛋白水平則明顯增高（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 TREM-1-PE flow cytometry chart in each group圖1 各處理組TREM-1流式細(xì)胞圖

Tab.1 Comparison of observation in each group表1 各處理組細(xì)胞觀察指標(biāo)的比較(n=5,±s)

Tab.1 Comparison of observation in each group表1 各處理組細(xì)胞觀察指標(biāo)的比較(n=5,±s)

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與LPS組比較，P＜0.05

組別Control組LPS組Pro組P1組P2組P3組P4組F TREM-1蛋白56.86±4.40 37.18±2.35a53.26±3.65b39.42±2.79a39.12±3.80a45.82±3.11b55.24±4.42b27.41＊＊TREM-1基因1±0 3.73±0.59a1.87±0.36b3.93±0.73a4.14±0.54a3.32±0.60a2.08±0.46b27.42＊＊TNF-α(ng/L) 109.87±9.34 190.35±15.68a105.27±7.83b202.30±19.27a190.33±18.25a126.85±11.25b113.25±7.06b52.37＊＊

2.2 各處理組TREM-1 mRNA表達(dá)水平 與LPS組比較，P4組細(xì)胞TREM-1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與Control組比較，LPS組TREM-1表達(dá)明顯增高（P＜0.05），見表1。

2.3 各處理組上清液中TNF-α水平 與Control組相比，LPS組、P1組、P2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平明顯增高（P＜0.05）。與LPS組比較，P3組、P4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），見表1。

3 討論

TREM-1是近來發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬等髓樣細(xì)胞上表達(dá)的表面分子，屬于免疫球蛋白超家族成員[1]。多項(xiàng)研究證實(shí)其在炎癥發(fā)生與級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)中起重要作用，是介導(dǎo)膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子。異丙酚具有良好的抗氧化作用和抑制細(xì)胞因子合成與釋放的功能[3]。但異丙酚是否可通過影響TREM-1而起到抑制炎癥反應(yīng)及其之間的劑量關(guān)系尚少見報(bào)道。

本研究顯示，THP-1細(xì)胞表面TREM-1一般情況下表達(dá)水平較高，而加入LPS后明顯降低，與多項(xiàng)的研究發(fā)現(xiàn)相反[4-5]。但Wong-Baeza等[6]采用不同濃度LPS誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞炎性反應(yīng)，結(jié)果顯示細(xì)胞表面TREM-1受體隨著LPS濃度的增加而呈下調(diào)趨勢(shì)，與本研究結(jié)果趨勢(shì)相一致。而van Bremen 等[7]在嚴(yán)重膿毒血癥患者中發(fā)現(xiàn)，TREM-1在單核細(xì)胞中表達(dá)升高，但在中性粒細(xì)胞中表達(dá)降低。Mazzucchelli等[8]在新生兒膿毒癥中也發(fā)現(xiàn)TREM-1在多型核白細(xì)胞中表達(dá)降低，而CD64表達(dá)明顯升高。但Mahdy等[9]用LPS誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的TREM-1受體并未隨著炎性反應(yīng)的加強(qiáng)而呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。這可能是由于：（1）本研究所采用的THP-1細(xì)胞是一種前單核細(xì)胞，與外周血中的單核細(xì)胞表面受體表達(dá)種類可能存在有一定的差異，TREM-1可能參與細(xì)胞分化功能[10]，而Cai等[11]研究發(fā)現(xiàn)TREM-1在單核細(xì)胞凋亡過程中有重要作用。（2）TREM-1在LPS存在時(shí)表達(dá)下調(diào)也可能是TREM-1受體活性自我限制效應(yīng)而使機(jī)體恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的一種保護(hù)機(jī)制[6]。因此，本研究可能提示TREM-1在不同的細(xì)胞中參與的反應(yīng)或者在相互調(diào)節(jié)通路中所起到的作用并不完全相同。

目前的研究表明，異丙酚可明顯降低血清中炎性因子水平，減弱單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的功能，呈現(xiàn)劑量依賴性，從而降低死亡率[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)異丙酚孵育THP-1細(xì)胞，細(xì)胞的狀態(tài)與Control組無明顯差異，異丙酚并不影響正常狀態(tài)下的細(xì)胞功能[3]；與LPS組相比發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞中的TREM-1 mRNA在異丙酚孵育中表達(dá)量下降，上清液中TNF-α的濃度也降低，這再次證實(shí)了異丙酚可明顯降低炎性因子水平，抑制炎性反應(yīng)。與Mihailidou等[13]的研究相類似，其研究發(fā)現(xiàn)在U937單核細(xì)胞中，地塞米松可通過TNF-α介導(dǎo)降低TREM-1的基因表達(dá)水平。但Dimopoulou等[14]的研究卻發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重膿毒血癥患者中TREM-1的基因表達(dá)量在單核細(xì)胞并沒有增加。與LPS組相比發(fā)現(xiàn)在異丙酚孵育的THP-1細(xì)胞中TREM-1 mRNA的表達(dá)量下降，而在THP-1細(xì)胞表面TREM-1的蛋白水平卻增加，這可能是由于異丙酚與LPS共同孵育的情況下，THP-1細(xì)胞TREM-1蛋白的降解水平也明顯降低，因而雖然TREM-1 mRNA指導(dǎo)TREM-1合成減少，但總趨勢(shì)表現(xiàn)為TREM-1蛋白表達(dá)量的增加，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上，本研究初步證明異丙酚可使LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎性反應(yīng)中TNF-α水平降低，抑制TREM-1 mRNA的表達(dá)，但沒有相應(yīng)的抑制細(xì)胞表面TREM-1蛋白水平的表達(dá)，其確切的分子及生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（2013-12-17收稿 2014-04-02修回）

（本文編輯 李國琪）

Effects of Propofol on Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1(TREM-1)by Lipopolysaccharide-Stimulated Human Monocyte Cell Lines

LU Liren1,ZHANG Liangqing2,LU Yan2
1 Department of Anesthesia,Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical University,Foshan 528000,China; 2 Department of Anesthesia,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College ZHANG Liangqing,E-mail:983275857@qq.com

ObjectiveTo evaluate the effects of propofol on TREM-1 expression in THP-1 cells stimulated by lipopolysaccharide(LPS).MethodsCells were divided into 7 groups:(1)control group;(2)LPS group that was exposed to LPS in final concentration of 100 μg/L;(3)Progroup that was incubated with 100 μmol/L propofol;(4-7)groups combined 100 μg/L LPS with propofol at different dose of 12.5 μmol/L(P1group),25 μmol/L(P2group),50 μmol/L(P3group),100 μmol/L(P4group)respectively.After 16 hours of incubation,the TNF-α concentration in supernatants were measured by ELISA.TREM-1 expression were examined by FACS and TREM-1 mRNA were detected using qRT-PCR.ResultsTREM-1 on THP-1 increased significantly in group P3and group P4compared with LPS group(P＜0.05).The concentrations of TNF-α in P3and P4(P＜0.05)decreased substantially in supernatant compared with LPS group.TREM-1 mRNA transcription level in group LPS rise considerably(P＜0.05)compared to that in control group,and it dropped greatly in group P4(P＜0.05)compared with that in group LPS.ConclusionPropofol could enhance TREM-1 expression on surface of THP-1 stimulated by LPS.Propofol reduces TNF-α level in culture supernatant.And propofol may restrain TREM-1 mRNA expression.

endotoxins;lipopolysaccharides;propofol;monocytes;tumor necrosis factor-alpha;triggering receptor expressed on myeloid cells 1

R364.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.007

1廣東佛山，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院麻醉科(郵編528000)；2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科

△通訊作者 E-mail:983275857@qq.com