趙偉偉 車京津 張彥彥 邵元霞 王俊乾

臨床研究

CD36 rs3211956和rs7755單核苷酸多態(tài)性與早發(fā)冠心病的相關性

趙偉偉 車京津△張彥彥 邵元霞 王俊乾

目的 探討早發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CHD）的危險因素，及CD36基因rs7755和rs3211956單核苷酸多態(tài)性（SNP）與早發(fā)CHD的相關性。方法連續(xù)篩選冠狀動脈造影證實的早發(fā)冠脈嚴重三支病變者（病變組）102例及冠脈造影正常者（正常組）72例，對比2組CHD的傳統(tǒng)危險因素，并用質譜法檢測所有入選者CD36 rs7755和rs3211956位點基因型，分析早發(fā)CHD的獨立危險因素。結果傳統(tǒng)危險因素中，男性、糖尿病、高血壓、高低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及低高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）是早發(fā)CHD的獨立危險因素。病變組中rs3211956的GT基因型分布低于正常組（χ2=8.042，P=0.005），而TT基因型分布高于正常組（χ2=6.191，P=0.014）；TT基因型者較含G等位基因者的體質指數(shù)（BMI）水平增高（P=0.037）。病變組rs7755的G等位基因的頻率高于正常組（χ2=3.636，P=0.047）；GG基因型的BMI水平高于A等位基因攜帶者（P＜0.001），而HDL-C水平低于另兩種基因型者（P＜0.001）。Logistic回歸分析顯示在分別調整了混雜因素后，rs3211956基因型GG、TT及rs7755基因型GG、GA均為早發(fā)CHD的獨立危險因素。結論CD36 rs3211956、rs7755的SNP可能是致早發(fā)CHD的獨立危險因素，且可能通過影響B(tài)MI和HDL-C而影響早發(fā)CHD的發(fā)生。

冠心??；多態(tài)性,單核苷酸；抗原,CD36；危險因素；rs3211956；rs7755

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢[1]。動脈粥樣硬化(AS)是由遺傳和環(huán)境等多種因素共同作用的結果[2]，因此研究早發(fā)CHD的危險因素和致早發(fā)CHD的遺傳背景，有可能早期識別早發(fā)CHD高危人群，進而早期預防。變性的低密度脂蛋白（LDL）和泡沫細胞是AS形成的兩大要素。清道夫受體（scarenger receptor，SR）是介導巨噬細胞攝取變性LDL形成泡沫細胞的重要介質，而CD36是B族SR中介導氧化LDL清除的主要成員[3]。有研究證實CD36基因多態(tài)性與脂質代謝異常[4]、胰島素抵抗[5]及代謝綜合征（MS）[6]有關，這些因素均為早發(fā)CHD的危險因素，但目前尚缺乏CD36基因多態(tài)性與早發(fā)CHD關系的報道。本研究旨在探討CD36 rs7755和rs3211956單核苷酸多態(tài)性（SNP）與早發(fā)CHD的相關性。

1 對象與方法

1.1 入選及排除標準 連續(xù)篩選2010年10月—2012年12月我院心內科擬診斷CHD并接受冠狀動造影檢查的住院患者，CHD發(fā)病年齡男性＜55歲，女性＜65歲。根據冠脈造影結果入選病例，按照定量冠脈造影法左前降支、左回旋支、右冠脈或左主干病變及右冠脈均有面積≥50％的狹窄，且至少一支面積≥70％狹窄作為病變組；三支冠脈均光滑無明顯狹窄為正常組。病變組男性、糖尿病、飲酒史、吸煙史和早發(fā)CHD家史比例高于正常組，見表1。排除標準：（1）合并嚴重肝腎功能異常，肝炎或丙氨酸轉氨酶（ALT）＞80 U/L，血肌酐（Scr）≥178 μmol/L。（2）合并嚴重感染、惡性腫瘤、甲狀腺疾病等。（3）合并血液系統(tǒng)疾病，如嚴重貧血、骨髓增生性疾病、凝血功能障礙性疾病等。（4）合并自身免疫性疾病，如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。（5）嚴重心臟瓣膜病患者。

Tab.1 Comparison of clinical data between two groups表1 病變組和正常組基本臨床資料比較

1.2 方法

1.2.1 實驗數(shù)據收集 測量空腹體質量、身高，計算體質指數(shù)（BMI）=體質量/身高2(kg/m2)。記錄性別、年齡、糖尿?。―M）、高血壓、腦卒中病史、吸煙史。采集空腹肘正中靜脈血，測定血脂、空腹血糖（FBG）、肝腎功能等臨床生化指標；另留取肘正中靜脈血3 mL，用于擇期提取基因組DNA。

1.2.2 DNA提取及檢測 采用淋巴細胞分離液法提取白細胞，置于-80℃凍存。應用濃鹽法提取DNA，利用分光光度法檢測DNA的含量，分別讀取波長280 nm、260 nm、230 nm下的光密度（OD）值，記錄樣本 DNA的濃度和純度。rs3211956和rs7755基因多態(tài)性采用質譜法測定。

1.2.3 冠脈造影及結果分析 采用荷蘭飛利浦公司FD20數(shù)字減影血管儀，采用Judkins法取7個體位投照進行選擇性冠狀動脈造影，左冠狀動脈采用左前斜頭位、右前斜頭位、左前斜足位、右前斜足位，右冠狀動脈采用左前斜、頭傾位、右前斜。結果由2名心導管專業(yè)醫(yī)師評定。按照定量冠狀動脈造影（Quantitative Coronary Angiography,QCA）法判定冠狀動脈狹窄處直徑比狹窄近心端正常冠狀動脈直徑減少的百分比。當主要冠脈或其主要分支面積≥50％的狹窄即診斷為冠心病。分別對左主干、左前降支、回旋支、右冠脈進行狹窄程度評定，其主要分支如對角支、鈍緣支歸屬相應主支進行統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料采用例（％）表示，組間比較采用χ2檢驗；擬和優(yōu)度χ2檢驗基因型分布是否符合Hardy Weinberg平衡。危險因素分析應用多元Logistic回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組實驗室指標比較 病變組白細胞（WBC）、FBG、BMI、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肌酐（Scr）、尿酸（UA）水平均高于正常組；而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著低于正常組（P＜0.05或P＜0.01）；2組血小板（Plt）、纖維蛋白原（Fbg）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、尿素氮（BUN）水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

2.2 基因檢測情況

2.2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗 分別對CD36基因座上rs3211956和rs7755的SNP基因型進行擬和優(yōu)度χ2檢驗。結果顯示這2個基因位點的SNP基因型在2組間的頻率分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

2.2.2 rs3211956與rs7755的基因型及等位基因在2組的分布 rs3211956基因SNP，基因型（TT/TG/ GG）在病變組與正常組的分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即病變組中GT基因型分布低于正常組，而TT基因型高于正常組，2組的等位基因（G/T）分布差異無統(tǒng)計學意義，見表3。rs7755基因SNP，病變組與正常組的基因型（AA/AG/GG）分布差異無統(tǒng)計學意義，但病變組G等位基因頻率高于正常組，見表4。

Tab.2 Comparison of clinical data between two groups表2 病變組和正常組實驗室指標比較

Tab.3 Distribution of rs3211956 SNP genotypes and alleles in two groups表3 2組患者rs3211956 SNP基因型和等位基因分布例（％）

2.2.3 CD36基因rs3211956、rs7755基因型分布及臨床資料比較 （1）rs3211956：TT基因型者的BMI水平高于 GG基因型者（P＜0.05），見表 5。（2）rs7755：GG基因型者的BMI水平高于AG和AA基因型者（P＜0.05），而GG基因型者的HDL-C水平則低于AG和AA基因型者（P＜0.05）；按照A等位基因顯性遺傳模型，GG基因型者BMI高于AA+AG基因型者（kg/m2：27.31±2.73 vs 24.53±3.25，t=3.614，P＜0.05）；HDL-C的水平較AA+AG組低（mmol/L：1.21±0.35 vs 1.52±0.74，t=5.072，P＜0.05），見表6。

2.2.4 Logistic回歸分析 為評價 CD36基因rs3211956和rs7755的SNP在眾多致CHD危險因素中的致病強度，應用二分類非條件逐步Logistic回歸分別對其進行分析。以冠脈是否為嚴重三支病變?yōu)閼兞浚?=冠脈造影正常，1=冠脈嚴重三支病變），以性別（0=女性，1=男性）、有無吸煙史、早發(fā)CHD家族史、腦卒中、高血壓、DM、MS、肥胖、高TG血癥、高TC血癥、低HDL-C血癥、高LDL-C血癥（0=無，1=有）及rs3211956基因多態(tài)性（雜合GT=1，純合GG+TT=0）為自變量進行多元Logistic回歸分析。結果顯示：男性、有高血壓、糖尿病、低HDL-C血癥、高LDL-C血癥為發(fā)生嚴重冠脈三支病變的危險因素，攜帶雜合GT基因型為保護因素，見表7。

Tab.5 Clinical characteristics of rs3211956 genotypes表5 rs3211956各基因型臨床特點

采用上述變量賦值標準對變量進行賦值[自變量rs7755基因多態(tài)性（隱性AA=0，顯性GG+GA= 1）]，進行多元Logistic回歸分析。結果顯示：男性、有高血壓、糖尿病、低HDL-C血癥、高LDL-C血癥、攜帶G等位基因為發(fā)生嚴重冠脈三支病變的危險因素，見表8。

Tab.6 Clinical characteristics of rs7755 genotypes表6 rs7755各基因型臨床特點

Tab.7 Results of multivariate Logistic regression analysis of rs3211956表7 rs3211956多元Logistic回歸分析結果

Tab.8 Results of multivariate Logistic regression analysis of rs7755表8 rs7755多元Logistic回歸結果

3 討論

3.1 CHD的經典危險因素與早發(fā)CHD 本研究顯示，病變組男性比例、飲酒史、吸煙史、早發(fā)CHD家族史、糖尿病所占比例，WBC、FBG、BMI、TG、TC、LDL-C、Scr、UA水平均顯著高于對照組；HDL-C則顯著低于對照組，在CHD的經典危險因素方面與以往的研究報道相似[7]。Logistic回歸分析顯示，男性比例、DM、高血壓、高LDL-C血癥、低HDL-C是早發(fā)CHD的獨立危險因素。

3.2 CD36的致動脈粥樣硬化作用 AS是CHD發(fā)生、發(fā)展的基礎，其形成的一個基本特征是源于巨噬細胞的泡沫細胞形成。這些泡沫細胞中的膽固醇和膽固醇酯來源于變性的脂質，主要為氧化LDL（ox-LDL）[8]。Endemann等[9]發(fā)現(xiàn)CD36可通過介導巨噬細胞攝取ox-LDL，形成泡沫細胞。此后關于CD36 在AS中作用的研究逐漸深入。Piechota等[10]通過分離急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血中單核細胞，證實ACS組和健康對照組的血液中ox-LDL無差異，但ACS組單核細胞表面的CD36的表達是健康對照組的6倍。還有研究提示CD36的低表達可延緩AS病變的發(fā)生和發(fā)展[11]。以上從正反兩方面證實了CD36在致動脈粥樣硬化性心臟病方面的重要作用。

在人類的基因組中，編碼CD36的基因位于7q11.2染色體上[12]。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90％以上。隨著基因分子生物技術的發(fā)展，CHD在基因水平上的研究逐步深入，CD36的SNP也越來越受到重視。

3.3 CD36基因rs3211956和rs7755基因多態(tài)性與早發(fā)CHD rs3211956位于CD36DNA序列的3′端。本研究中，病變組中rs3211956雜合基因型(GT)分布顯著低于正常組，顯示出雜合子對于冠脈粥樣硬化的保護作用。目前，對CD36基因雜合子的保護性或易感性方面的報道比較少。Banerjee等[13]通過對北印度人群CD36 rs1761667(G＞A)的SNP與2型糖尿病的關系進行研究，提出雜合基因型（AG）與2型糖尿病顯著相關。而本研究中TT基因型在病變組中分布顯著高于正常組，則提示TT基因型有致AS作用。與之相似的，美國一項研究通過對比急性心肌梗死與穩(wěn)定型心絞痛人群的 CD36 rs3211956（G/T）基因分布，證實T等位基因和急性心肌梗死顯著相關[14]。本研究還顯示rs3211956的SNP中不同基因型間的BMI差異有統(tǒng)計學意義，TT基因型者的BMI水平較高。相似的是，Heni等[15]通過對1 790例有患DM風險的歐洲人的4個CD36位點的SNP進行分析，也提示rs3211956（T/G）SNP不同基因型間的BMI差異有統(tǒng)計學意義（TT＞TG＞GG，TT+TG＞GG，P＜0.01）。

CD36 rs7755位于CD36DNA序列的3′端的非編碼區(qū)，對其研究大多集中在MS方面。Love-Gregory等[16]通過對2 020例非裔美國人的CD36 rs7755 的SNP與MS及脂質代謝的關系進行研究，結果顯示CD36 rs7755的SNP與BMI＞30 kg/m2及腹圍＞100 cm有關，rs7755的G等位基因是MS的獨立危險因素。本研究顯示GG基因型攜帶者的BMI水平顯著高于AA基因型患者和攜帶A等位基因的患者。日本一項對515例健康青年人的研究顯示，CD36 rs7755（A/G）等位基因G與LDL-C和TC呈正相關（r分別為0.13和0.12，P＜0.01），但是與BMI無相關性，多因素分析顯示CD36 rs7755的G等位基因是高LDL-C的獨立危險因素[17]。本研究未觀察出CD36 rs7755SNP與LDL-C之間的聯(lián)系，但GG基因型者的HDL-C水平顯著低于AG和AA基因型者，與以往的CHD傳統(tǒng)危險因素研究相似，本研究也顯示高LDL-C、低HDL-C均為早發(fā)CHD的獨立危險因素。另外，冠脈三支病變組的G等位基因頻率高于對照組（P＜0.05），也提示該等位基因與早發(fā)冠脈三支病變有關。

本研究顯示CD36 rs3211956和rs7755的SNP與早發(fā)CHD有關，但其相關機制尚不清楚，推斷可能與該兩位點SNP影響B(tài)MI及HDL-C的水平有關。BMI值每升高1％，CHD的患病風險在女性提高3.3％，在男性提高3.6％[18]。同時，低HDL-C是 CHD的獨立危險因素[19]。因此，CD36 rs3211956和rs7755的SNP可能通過影響B(tài)MI及HDL-C的代謝而影響冠脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)CD36的SNP與CHD的發(fā)生有關，但其對CD36功能的影響目前尚不清楚。今后將進一步擴大樣本，并增加對CD36其他位點SNP的研究，為早發(fā)冠心病的發(fā)現(xiàn)和治療提供更多理論依據。

[1]Hosseini SK,Soleimani A,Salarifar M,et al.Demographics and angiographic findings in patients under 35 years of age with acute ST elevation myocardial infarction[J].J Tehran Heart Cent,2011,6(2): 62-67.

[2]Ghassibe-Sabbagh M,Platt DE,Youhanna S,et al.Genetic and environmental influences on total plasma homocysteine and its role in coronary artery disease risk[J].Atherosclerosis,2012,222(1):180-186.doi:10.1016/j.atherosclerosis.2012.02.035.

[3]Moore KJ,Freeman MW.Scavenger receptors in atherosclerosis beyond lipid uptake[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(8): 1702-1711.

[4]Ma X,Bacci S,Mlynarski W,et al.A common haplotype at the CD36 locus is associated with high free fatty acid levels and increased cardiovascular risk in Caucasians[J].Hum Mol Genet, 2004,13(19):2197-2205.

[5]Corpeleijn E,Van Der Kallen CJH,Kruijshoop M,et al.Direct association of a promoter polymorphism in the CD36/FAT fatty acid transporter gene with Type 2 diabetes mellitus and insulin resistance[J].Diabet Med,2006,23(8):907-911.

[6]Noel SE,Lai CQ,Mattei J,et al.Variants of the CD36 gene and metabolic syndrome in Boston Puerto Rican adults[J].Atherosclerosis, 2010,211(1):210-215.doi:10.1016/j.atherosclerosis.2010.02.009.

[7]Kuulasmaa K,Tunstall-Pedoe H,Dobson A,et al.Estimation of contribution of changes in classic risk factors to trends in coronaryevent rates across the WHO MONICA Project populations[J].Lancet,2000,355(9205):675-687.

[8]Primo L,Ferrandi C,Roca C,et al.Identification of CD36 molecular features required for its in vitro angiostatic activity[J].FASEB J, 2005,19(12):1713-1715.

[9]Endemann G,Stanton LW,Madden KS,et al.CD36 is a receptor for oxidized low density lipoprotein[J].Journal of Biological Chemistry, 1993,268(16):11811-11816.

[10]Piechota M,Banaszewska A,Dudziak J,et al.Highly Upregulated Expression of CD36 and MSR1 in Circulating Monocytes of Patients with Acute Coronary Syndromes[J].Protein J,2012,31(6):511-518. doi:10.1007/s10930-012-9431-8.

[11]Kuchibhotla S,Vanegas D,Kennedy DJ,et al.Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knock-out mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor AI/II [J].Cardiovasc Res,2008,78(1):185-196.

[12]Ra? ME,Safranow K,Poncyljusz W.Molecular basis of human CD36 gene mutations[J].Mol Med,2006,13(5-6):288-296.

[13]Banerjee M,Gautam S,Saxena M,et al.Association of CD36 genevariants rs1761667(G＞A)and rs1527483(C＞T)with Type 2 diabetes in North Indian population[J].International Journal of Diabetes Mellitus,2010,2(3):179-183.

[14]Knowles JW,Wang H,Itakura H,et al.Association of polymorphisms in platelet and hemostasis system genes with acute myocardial infarction[J].Am Heart J,2007,154(6):1052-1058.

[15]Heni M,Müssig K,Machicao F,et al.Variants in the CD36 Gene Locus Determine Whole-Body Adiposity,but Have No Independent Effect on Insulin Sensitivity[J].Obesity(Silver Spring),2011,19(5): 1004-1009.doi:10.1038/oby.2010.251.

[16]Love-Gregory L,Sherva R,Sun L,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.doi: 10.1093/hmg/ddn060.

[17]Morii T,Ohno Y,Kato N,et al.CD36 single nucleotide polymorphism is associated with variation in low-density lipoprotein-cholesterol in young Japanese men[J].Biomarkers,2009,14(4):207-212.doi:10.1080/13547500902811274.

[18]Anderson JW,Konz EC.Obesity and disease management:effects of weight loss on comorbid conditions[J].Obes Res,2001,9(S11): 326S-334S.

[19]Tuteja S,Rader DJ.High Density Lipoproteins in the Prevention of Cardiovascular Disease:Changing the Paradigm[J].Clin Pharmacol Ther,2014,96(1):48-56.doi:10.1038/clpt.2014.79.

（2014-05-12收稿 2014-08-18修回）

（本文編輯 李鵬）

The Association of CD36 rs7755 and rs3211956 Single Nucleotide Polymorphism with Premature Coronary Heart Disease

ZHAO Weiwei,CHE Jingjin△,ZHANG Yanyan,SHAO Yuanxia,WANG Junqian
The Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China
△

E-mail：jingjinche@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the risk factors of premature atherosclerotic three-vessel coronary artery disease(CHD),and the association between single nucleotide polymorphism(SNP)of CD36 rs3211956,rs7755 and premature CHD.MethodsPatient with premature three-vessel coronary artery disease(n=102)which were confirmed by consecutive coronary angiogram(lesion group)and patients(n=72)without CHD(control group)were enrolled in the study.Conventional CHD risk factors were compared between the two groups as well as SNPs of CD36 rs3211956 and rs7755 to disclose independent risk factor for CHD,which were measured by mass spectrometry.ResultsAmong the conventional CHD risk factors,male,HBP,high LDL-C,low HDL-C were independent risk factors of premature CHD.The GT genotype proportion of rs3211956 was significantly lower(χ2=8.042，P=0.005)in the lesion group than that in control group while the TT genotype proportion is significantly higher in lesion group compared with that in control group(χ2=6.191，P=0.014).Patients with the TT genotype have higher score of BMI than patients with GG or GT genotype(P=0.037).The G allele proportion of rs7755 in the lesion group was significantly higher than control group(χ2=3.636,P=0.047).Patients of the GG genotype have higher scores of BMI but lower level of HDL-C than those with AA or AG genotype(P＜0.001).Logistic regression analysis revealed that after excluding a number of confounding factors,GG and TT genotype of rs3211956 and GG and GA genotype of rs7755 were respectively one of the independent risk factors for premature CHD.ConclusionThe SNPs of CD36 rs7755 and rs3211956 may be the independent risk factors of premature coronary heart disease and might affect the the onset of CHD by affectting BMI and HDL-C.

coronary heart disease；polymorphism,single nucleotide；antigens,CD36；risk factors；rs3211956；rs7755

R541.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.013

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院心臟科（郵編300211）△

E-mail：jingjinche@aliyun.com