王淑媛魯衍強馬少杰△ 黃京希楊凱云熊 敏周玉珍楊 琦

湘潭市漢族女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布及其與血漿Hcy水平的關(guān)系

王淑媛1魯衍強2馬少杰2△黃京希1楊凱云1熊 敏1周玉珍1楊 琦3

目的 分析湖南省湘潭市女性5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T、A1298C及甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）A66G位點基因多態(tài)性的分布特征，并分析其多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平的關(guān)系。方法以湘潭市1 701例女性為研究對象，檢測其MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點基因多態(tài)性，并對其中110例孕期女性檢測其血漿Hcy水平。統(tǒng)計分析本地區(qū)基因多態(tài)性的分布特征，并與淄博、鄭州、煙臺、鎮(zhèn)江、松滋、惠州、瓊海等地區(qū)進行比較；分析多態(tài)性與血漿Hcy水平的關(guān)系。結(jié)果湘潭市女性的MTHFR C677T位點TT純合突變基因型頻率為12.6％，高于惠州（10.9％）、瓊海（6.1％），低于淄博(43.6％)、鄭州(36.8％)、煙臺(32.2％)、鎮(zhèn)江(21.8％)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與松滋相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MTHFR A1298C位點CC純合突變基因型頻率為4.8％，低于瓊海（7.1％）、高于淄博（1.4％）、鄭州（2.4％）、煙臺（1.8％）、鎮(zhèn)江（3.5％）、松滋（2.6％），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。MTRR A66G位點GG純合突變基因型頻率為6.8％，高于淄博（4.8％），低于瓊海（9.3％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。血漿Hcy濃度與MTHFR C677T位點基因型多態(tài)性有關(guān)，TT型人群Hcy濃度高于CT型人群和CC型人群（μmol/L: 8.52±2.01 vs 5.94±1.47 vs 5.71±0.18）；血漿Hcy濃度與MTHFR A1298C位點基因型多態(tài)性有關(guān)，CC型人群Hcy濃度高于AA型人群和AC型人群（μmol/L:9.83±2.26 vs 6.35±2.13 vs 5.55±1.75）；血漿Hcy濃度與MTRR A66G位點基因型無關(guān)。結(jié)論湘潭市女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性頻率不同于其他地區(qū)，具有地域特異性。MTHFR C677T、A1298C位點多態(tài)性與Hcy水平有關(guān)。

亞甲基四氫葉酸還原酶；甲硫氨酸合成酶還原酶；基因多態(tài)性；同型半胱氨酸

我國是出生缺陷高發(fā)國家，出生缺陷總發(fā)生率約5.6％[1]。葉酸攝入不足或者不能被人體有效利用是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因[2]。研究表明，5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（methionine synthase reductase，MTRR）是葉酸轉(zhuǎn)運和代謝的關(guān)鍵酶[3]。MTHFR基因C677T位點、A1298C位點與MTRR基因A66G位點的多態(tài)性會造成MTHFR 與MTRR的酶活性降低，造成葉酸代謝異常，使DNA低甲基化導(dǎo)致唐氏綜合征[4]。葉酸代謝障礙會使同型半胱氨酸（Hcy）水平升高，而高同型半胱氨酸（HHcy）與神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、先天性心臟病等出生缺陷[5]，以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[6]、妊娠期高血壓等孕期疾病密切相關(guān)[7]。育齡婦女作為一個特殊的群體，體內(nèi)葉酸營養(yǎng)素的水平對于胎兒的健康生長發(fā)育和孕婦的身體健康都有極其重要的影響。本研究通過檢測湘潭市育齡女性體內(nèi)MTHFR和MTRR編碼基因的3個多態(tài)性位點，預(yù)測受檢者的葉酸代謝能力，從而指導(dǎo)孕婦在孕前及孕期適量補充葉酸，維持正常Hcy水平，預(yù)防出生缺陷的發(fā)生。同時了解湘潭地區(qū)婦女葉酸代謝相關(guān)基因的分布特點與群體遺傳學(xué)特征，為本地區(qū)預(yù)防出生缺陷制定針對性的干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取湘潭市自2012年11月—2014年2月到我院進行孕前與孕期檢查的無親緣關(guān)系女性1 701例，均為漢族，平均年齡（26.72±4.60）歲。

1.2 方法

1.2.1 基因分型檢測 經(jīng)受檢者本人知情同意后，采集受檢者的口腔黏膜上皮細胞，利用硅膠吸附方法抽提樣本的基因組DNA。采用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測分析葉酸代謝相關(guān)的3個DNA單核苷酸多態(tài)性位點（MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G）。每個反應(yīng)體系10 μL：包含1 μL濃度為20 mg/L的DNA模板，5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB探針，3.5 μL去離子水。其中，MTHFR C677T、A1298C與MTHRR A66G具體探針信息見表1，相關(guān)儀器、試劑均購自美國ABI公司。反應(yīng)條件為95℃預(yù)熱10 min；92℃變性15 s，60℃延伸1 min，20個循環(huán)；89℃變性15 s，60℃延伸1 min 30 s；30個循環(huán)。反應(yīng)完成后，用ABI7900型熒光定量PCR儀讀取樣品的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結(jié)果。

Tab.1 Detection sequences of gene MTHFR and MTRR表1 Taqman-MGB探針?biāo)谖恢?/p>

1.2.2 血漿Hcy水平檢測 對其中110例孕期女性檢測其血漿Hcy水平。空腹抽取受檢查者肘正中靜脈血3 mL，注入EDTA抗凝血管，混勻后靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，分離血清于EP管,采用化學(xué)發(fā)光法測定Hcy。Hcy檢測試劑盒購自德國BAYER公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用HaploView 4.2軟件進行單核甘酸多態(tài)性的Hardy-Weinberg平衡、連鎖不平衡水平和單倍型結(jié)構(gòu)分析。計量資料以±s表示，比較采用方差分析；計數(shù)資料采用例（％）表示，比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析 對收集到的湘潭市女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點的檢測數(shù)據(jù)進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2值分別為0.39、0.05和0.19，P＞0.5。說明樣本具有本區(qū)域群體代表性。

2.2 湘潭市女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點基因多態(tài)性分布特點

2.2.1 MTHFR C677T位點基因多態(tài)性的分布特點 湘潭市女性的MTHFR C677T位點的TT基因型頻率為12.6％，高于惠州、瓊海，低于淄博、鄭州、煙臺、鎮(zhèn)江（均P＜0.01）。與松滋相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.2.2 MTHFR A1298C位點基因多態(tài)性的分布特點 湘潭市女性MTHFR A1298C位點的CC基因型頻率為4.8％，低于瓊海，高于淄博、鄭州、煙臺、鎮(zhèn)江、松滋（均P＜0.05）；與惠州差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.2.3 MTRR A66G位點基因多態(tài)性的分布特點 湘潭市女性MTRR基因A66G位點的GG基因型頻率為6.8％，高于淄博，低于瓊海（P＜0.05），與其他地區(qū)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

Tab.2 Comparison of MTHFR C677T genotype distribution and frequencies in different areas表2 不同地區(qū)漢族女性MTHFR C677T基因型頻率分布比較 例(％)

Tab.3 Comparison of MTHFR A1298C genotype distribution and frequencies in different areas表3 不同地區(qū)漢族女性MTHFR A1298C基因型頻率分布比較 例(％)

Tab.4 Comparison of MTRR A66G genotype distribution and frequencies in different areas表4 不同地區(qū)漢族女性MTRR A66G基因型頻率分布比較 例(％)

2.3 MTHFR C677T和A1298C兩位點連鎖情況及單倍型分析 單倍型分析表明，存在4種組合：CA (43.4％)、TA(34.9％)、CC(21.6％)、TC(0.1％)。兩位點間存在強連鎖不平衡現(xiàn)象（D’=0.986），見表5。

Tab.5 Comparison of MTHFR C677T and A1298C linkage analysis among Han women in Xiangtan city表5 湘潭市漢族女性MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布 例(％)

2.4 血漿Hcy濃度與MTHFR C677T位點、A1298C位點以及MTRR基因A66G位點基因多態(tài)性的關(guān)系 3種MTHFR C677T基因型的Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別是TT型＞CT型＞CC型（P＜0.05）；3種MTHFR A1298C基因型的Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別是CC型＞AA型＞AC型（P＜0.05）。MTRR基因A66G位點不同基因型的血漿Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表6。

Tab.6 Analysis of variance of concentration of plasma Hcy and MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G gene polymorphism表6 3種基因不同基因型的血漿Hcy濃度比較（mol/L，±s）

Tab.6 Analysis of variance of concentration of plasma Hcy and MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G gene polymorphism表6 3種基因不同基因型的血漿Hcy濃度比較（mol/L，±s）

＊P＜0.05；a與（1）比較，b與（2）比較,P＜0.05

MTHFR C677T基因型CC（1）CT（2）TT（3）F n Hcy n Hcy MTHFRA 1298C基因型AC（1）AA（2）CC（3）Hcy n 4.98±1.76 7.09±3.16 4.98±2.67 2.424 47 46 17 5.71±0.18 5.94±1.47a8.52±2.01ab4.932＊37 68 5 5.55±1.75 6.35±2.13a9.83±2.26ab3.811＊MTRR A66G基因型AA（1）AG（2）GG（3）60 42 8

3 討論

湖南省是出生缺陷高發(fā)區(qū)，近十年出生缺陷發(fā)生率逐年上升，從2003年的124.33/萬到2012年的204.96/萬。其中，先天性心臟病占66.89％（第1位），總唇腭裂占12.51％（第4位），神經(jīng)管缺陷占3.57％（第10位）[15]。遺傳因素是出生缺陷的重要影響因素，MTHFR基因C677T位點的多態(tài)性會造成其編碼的氨基酸發(fā)生改變，MTHFR C677T位點為TT基因型是神經(jīng)管畸形發(fā)生的遺傳高風(fēng)險因素，TT基因型比CC基因型人群的MTHFR酶活性下降60％～70％[16]。且MTHFR C677T和A1298C存在協(xié)同作用，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低，影響葉酸代謝，使Hcy水平升高，與先天性心臟病等多種出生缺陷相關(guān)。

MTHFR兩位點存在強連鎖不平衡，與貴州布依族和苗族人群的報道類似[17]。湘潭市漢族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點多態(tài)性分布與其他地區(qū)漢族女性存在差異，可能與人群對不同疾病的易感性有關(guān)。MTHFR C677T位點T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低的趨勢，與我國出生缺陷發(fā)病率北方高南方低的趨勢一致。研究表明，T基因型女性在未服用葉酸增補劑及低葉酸飲食的情況下，其胎兒唇腭裂的發(fā)生風(fēng)險均會增加，若以上兩種情況同時存在，則風(fēng)險進一步增高。反之，如果能夠補服葉酸增補劑、提高飲食中葉酸的含量則可以降低胎兒唇腭裂的發(fā)生風(fēng)險[18]。

通過對不同MTHFR和MTRR酶活性組Hcy水平的比較，表明MTHFR的基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶的活性降低是Hcy水平升高的危險因素。由于基因多態(tài)性導(dǎo)致MTHFR酶活性降低后，體內(nèi)Hcy向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化會受到限制，導(dǎo)致血漿Hcy水平升高。Hcy具有細胞毒性，可以使巰基氧化，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，損傷血管內(nèi)皮細胞并增加血栓形成的傾向，影響子宮胎盤血流，導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育的異常。

目前的孕期保健措施是從孕前3個月到孕早期3個月，每天增補葉酸0.4 mg。對于那些由基因多態(tài)性造成葉酸代謝障礙的人群，在補充相同劑量葉酸的情況下，紅細胞葉酸的濃度較正常人低，Hcy水平明顯升高。因此，通過對育齡女性進行遺傳篩查，針對存在葉酸代謝障礙的遺傳風(fēng)險人群，采取增加營養(yǎng)素補充、加強紅細胞葉酸水平監(jiān)測、提高產(chǎn)前篩查和孕期管理依從性等干預(yù)措施，是有效達到出生缺陷及孕期疾病一級預(yù)防目的的重要方法，也是提高人口素質(zhì)的必要手段。

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（2014-04-25收稿 2014-07-23修回）

（本文編輯 閆娟）

Relationship of Plasma Homocysteine with Gene Polymorphisms of MTHFR and MTRR among Han Women in Xiangtan City

WANG Shuyuan1,LU Yanqiang2,MA Shaojie2△,HUANG Jingxi1,YANG Kaiyun1,XIONG Min1,ZHOU Yuzhen1,YANG Qi3
1 Xiangtan Maternal and Child Health Hospital,Hunan 411100,China；2 Shanghai Institute of Target Molecules；3 National Center for Women and Children’s Health,Chinese Center for Disease Control and Prevention△

E-mail：mashaojie@genechina.com

ObjectiveTo investigate the relationship of plasma homocysteine with the genotype distribution of MTHFR and MTRR among Chinese Han women in Xiangtan.MethodsMTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G genotyping was analyzed to detect the distribution of gene polymorphisms among 1 701 women from Xiangtan city then the data were compared with the rest of the Han women in Zibo,Zhengzhou,Yantai,Zhenjiang,Songzi,Huizhou,Qionghai.Plasma Hcy levels from 110 patients were measured and analyzed the correlation with gene polymorphisms.ResultsThe frequency of MTHFR C677T genotype and allele frequencies in Xiangtan is 12.6％which is higher than Huizhou(10.9％)and Qionghai (6.1％)but lower than Zibo(43.6％),Zhengzhou(36.8％),Yantai(32.2％),Zhenjiang(21.8％)with statistically significant difference(P＜0.05).There is no significant different in MTHFR C677T between Xiangtan and Songzi.The frequency of MTHFR A1298C genotype and allele frequencies in Xiangtan is 4.8％which is lower than Qionghai（7.1％）but higher than Zibo （1.4％），Zhengzhou（2.4％）,Yantai（1.8％）,Zhenjiang（3.5％）and Songzi（2.6％）with statistically significant difference. The frenquency of MTRR A66G genotype and allele frequencies in Xiangtan is 6.8％which is higher than Zibo(4.8％)but lower than Qionghai(9.3％)with statistically signifcant difference.Plasma Hcy concentration correlate with MTHFR C677T, Hcy concentration in TT population is higher than that in CT and CC population（μmol/L:8.52±2.01 vs 5.94±1.47 vs 5.71± 0.18）；Plasma Hcy concentration also correlate with MTHFR A1298C and Hcy concentration in CC population is higher than AA and AC population（μmol/L:9.83±2.26 vs 6.35±2.13 vs 5.55±1.75）；Plasma Hcy concentration does not correlate with MTRR A66G.ConclusionThe gene polymorphism of MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G among the Hanwomen in Xiangtan was statistically different from other selected regions of China.Mutation in MTHFR C677T and A1298C were associated with elevated plasma levels of Hcy.

methylenetetrahydrofolate reductase;methionine synthase reductase;polymorphism;homocysteine

R715.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.015

中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心婦幼保健分子遺傳醫(yī)學(xué)研究專項計劃（FY-ZX-ZD-0018）

1湖南省湘潭市婦幼保健院（郵編411100）；2上海靶向分子醫(yī)學(xué)研究所；3中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心△

E-mail：mashaojie@genechina.com