王小琴 彭聿平 劉 展 邱一華

實(shí)驗(yàn)研究

Th17和Treg細(xì)胞來(lái)源的兒茶酚胺在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎中的作用

王小琴 彭聿平 劉 展 邱一華△

目的 探討膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Th17和Treg細(xì)胞來(lái)源的兒茶酚胺（CAs）的作用。方法隨機(jī)將18只雄性DBA/1小鼠分為對(duì)照組、CIA模型Ⅰ組（35 d）和CIA模型Ⅱ組（55 d）。Ⅱ型膠原乳劑尾根部注射制備CIA小鼠模型。Real-time PCR法檢測(cè)淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt，相關(guān)細(xì)胞因子IL-17和IL-22，Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β以及酪氨酸羥化酶（TH）的mRNA表達(dá)。免疫熒光組織化學(xué)染色法觀察淋巴結(jié)中ROR-γt和Foxp3分別與TH、囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體-2 （VMAT-2）和單胺氧化酶（MAO）的共定位情況。結(jié)果與對(duì)照組相比，CIA模型Ⅰ組和模型Ⅱ組的小鼠淋巴結(jié)中ROR-γ、IL-17、TH和IL-22的mRNA表達(dá)增加；Foxp3和TGF-β的mRNA表達(dá)減少；其中模型Ⅱ組IL-17的mRNA表達(dá)與模型Ⅰ組相比有所降低。對(duì)照組和CIA模型Ⅰ組及模型Ⅱ組的小鼠淋巴結(jié)中存在ROR-γt和Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO的共定位細(xì)胞。CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中ROR-γt/TH、ROR-γt/VMAT-2和ROR-γt/ MAO雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，模型Ⅱ組中的這些雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與模型Ⅰ組相比有所減少。結(jié)論CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞合成CAs的能力增強(qiáng)，這種Th17細(xì)胞來(lái)源的CAs的增加可能在CIA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有一定的抗炎作用。

關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕；兒茶酚胺類；T淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)性；酪氨酸單氧化酶；Th17細(xì)胞；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

兒茶酚胺（catecholamines,CAs）一直被認(rèn)為主要由神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞合成和分泌。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞也能合成CAs[1]。筆者前期研究顯示淋巴細(xì)胞能夠表達(dá)合成CAs的限速酶酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）[2]。淋巴細(xì)胞來(lái)源的CAs對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖、凋亡及分化起調(diào)節(jié)作用[3-5]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以關(guān)節(jié)慢性滑膜炎為主的自身免疫性疾病[6]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis,CIA）是當(dāng)前研究RA較理想和最為常用的動(dòng)物模型。雖然RA的發(fā)病機(jī)制不是十分明確，但有研究表明CD4+T細(xì)胞在RA致病機(jī)制中具有重要作用[7]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞2個(gè)細(xì)胞亞群。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Th17和Treg細(xì)胞也是CD4+T細(xì)胞的2個(gè)重要亞群[8]。Th17細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素（IL）-17和IL-22，其特異性轉(zhuǎn)錄因子是ROR-γt；Treg細(xì)胞主要分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β，其特異性轉(zhuǎn)錄因子是Foxp3。RA患者滑膜液及滑膜組織中被發(fā)現(xiàn)存在IL-17，Treg細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞成為RA的治療措施之一亦有報(bào)道[9-10]。筆者最近研究發(fā)現(xiàn)，CIA小鼠滑膜組織中CD4+T能夠合成CAs，且具有一定的抗炎作用[11]。本研究借助CIA小鼠模型，探討淋巴組織中Th17和Treg細(xì)胞能否合成CAs，以及Th17和Treg細(xì)胞來(lái)源的CAs在CIA中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)近交系DBA/1小鼠18只,8～10周齡,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，采用抽簽法將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組和CIA模型Ⅰ組（35 d）和CIA模型Ⅱ組（55 d）。

1.2 主要試劑 小鼠抗ROR-γt、Foxp3、囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體-2 （VMAT-2）和單胺氧化酶（MAO）抗體均購(gòu)于Santa cruz公司；小鼠抗TH抗體購(gòu)于Millipore公司；雞Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ,CⅡ）購(gòu)于Sigma公司；弗氏完全佐劑（CFA）購(gòu)于Chondrex公司；脂多糖（LPS）購(gòu)于Sigma公司。FITC羊抗小鼠抗體購(gòu)自Sigma公司；羅丹明標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 CIA模型制備 等體積CFA與在0.1 mol/L冰醋酸中溶解的CⅡ（2 g/L）混合，充分乳化制成膠原乳劑。在小鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射0.1 mL膠原乳劑，初次免疫后21 d在腹腔注射該膠原乳劑0.1 mL加強(qiáng)免疫，28 d腹腔注射LPS 20 μg加速關(guān)節(jié)炎發(fā)生。從加強(qiáng)免疫后開始,每隔2 d對(duì)每只小鼠4個(gè)足爪進(jìn)行評(píng)分，直至初次免疫后55 d為止。關(guān)節(jié)炎分級(jí)評(píng)估：0分，所有的關(guān)節(jié)無(wú)任何紅腫；1分，輕度的紅和（或）腫；2分，顯著的紅腫；3分，關(guān)節(jié)僵硬或運(yùn)動(dòng)受限。每只小鼠4個(gè)足爪均評(píng)分，最高分為12分。

1.4 Real-time PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá) 取各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)，提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。引物由Invitrogen生物技術(shù)公司合成，序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min預(yù)變性，95℃20 s，61℃20 s，72℃20 s，循環(huán)40次。

Tab.1 The primer sequences表1 引物序列

1.5 免疫熒光組織化學(xué)染色 初次免疫后35 d或55 d，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔麻醉后，灌注、固定、取腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行冰凍切片，片厚25 μm,加山羊血清封閉30 min，加入ROR-γt抗體后分別加入TH、VMAT-2或MAO抗體；或者加入Foxp3抗體后分別加入TH、VMAT-2或MAO抗體。4℃孵育過(guò)夜，加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠和羅丹明標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育4 h，PBS漂洗，甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)讀取5個(gè)視野進(jìn)行照相,取5張片子，然后統(tǒng)計(jì)所有切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)總數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間多重比較用采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠淋巴結(jié)中Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果 CIA模型組淋巴結(jié)中ROR-γt、IL-17及IL-22 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組增高，IL-17 mRNA的表達(dá)在CIA模型Ⅱ組較CIA模型Ⅰ組明顯降低（均P＜0.05）。ROR-γt和IL-22的表達(dá)在2個(gè)模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIA模型Ⅰ組淋巴結(jié)中Foxp3 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，CIA模型Ⅱ組較對(duì)照組明顯降低。CIA模型組TGF-β的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低，但2個(gè)模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIA模型組TH mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加，但2個(gè)模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Tab.2 Gene expression level in lymph nodes of mice from each group表2 各組小鼠淋巴結(jié)中各基因表達(dá)的變化(n=3,±s)

Tab.2 Gene expression level in lymph nodes of mice from each group表2 各組小鼠淋巴結(jié)中各基因表達(dá)的變化(n=3,±s)

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與CIA模型Ⅰ組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F ROR-γt 1 4.53±0.52a3.53±0.50a19.170＊＊IL-17 1 7.89±0.75a4.33±0.95ab72.703＊＊IL-22 1 2.68±0.53a2.26±0.22a20.974＊＊組別對(duì)照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F Foxp3 1 0.90±0.05 0.80±0.12a6.028＊TGF-β 1 0.53±0.15a0.74±0.06a18.169＊＊TH 1 1.83±0.19a1.87±0.20a9.211＊

2.2 淋巴結(jié)中的 Th17細(xì)胞合成、儲(chǔ)存和降解CAs 對(duì)照組和CIA模型組淋巴結(jié)中均有ROR-γt分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞存在，即Th17細(xì)胞能夠合成、儲(chǔ)存、降解CAs，見(jiàn)圖1。CIA模型組淋巴結(jié)中 ROR-γt/TH、ROR-γt/ VMAT-2、ROR-γt/MAO共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于對(duì)照組，且模型Ⅱ組的ROR-γt/TH和ROR-γt/ MAO共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與模型Ⅰ組相比顯著降低（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 Number of Double-positive cell in lymph nodes from mice in each group表3 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（n=3,±s）

Tab.3 Number of Double-positive cell in lymph nodes from mice in each group表3 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（n=3,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與CIA模型Ⅰ組比較，P＜0.05；表3同

組別對(duì)照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F ROR-γt/TH 23.0±3.6 40.3±3.2a33.0±3.0ab21.072＊＊ROR-γt/VMAT-2 30.7±4.5 57.7±10.0a46.0±7.0a9.727＊ROR-γt/MAO 32.3±4.5 61.0±4.4a48.3±5.1ab28.284＊＊

2.3 淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞能夠表達(dá)TH、VMAT-2和MAO 對(duì)照組和CIA模型組淋巴結(jié)中均有Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞存在，即Treg細(xì)胞能夠合成、儲(chǔ)存、降解CAs，見(jiàn)圖2。3組間Foxp3/TH、Foxp3/VMAT-2、Foxp3/MAO共定位的雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

Tab.4 Number of Double-positive cell in lymph nodes of mice from each group表4 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) （n=3,±s）

Tab.4 Number of Double-positive cell in lymph nodes of mice from each group表4 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) （n=3,±s）

組別對(duì)照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F Foxp3/TH 23.7±3.1 25.7±3.1 25.0±1.0 0.475 Foxp3/VMAT-2 26.3±3.5 31.0±4.6 29.0±4.6 0.908 Foxp3/MAO 30.3±4.2 34.3±4.5 33.0±3.5 0.752

3 討論

RA以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕卣?，是一種可累及全身的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其病因不是十分明確，與多種因素有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為CD4+T細(xì)胞在RA的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用[7]。Th17和Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞中2個(gè)重要的亞群。有研究報(bào)道，RA患者外周血存在致炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子失衡及Th17/Treg的細(xì)胞比例失調(diào)的現(xiàn)象[12]。本研究中顯示CIA模型組小鼠的淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的ROR-γt mRNA表達(dá)增加，而Treg細(xì)胞的Foxp3 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比有所降低，說(shuō)明CIA模型組淋巴結(jié)中存在Th17/ Treg細(xì)胞比例失調(diào)。此外，CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中致炎細(xì)胞因子IL-17和IL-22 mRNA的表達(dá)增加，而抗炎細(xì)胞因子TGF-β mRNA表達(dá)減少，說(shuō)明CIA模型組的淋巴結(jié)中存在細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子的失衡。這種細(xì)胞比例及致炎/抗炎細(xì)胞因子的失衡在模型組（55 d）得到一定程度的緩和。

CIA小鼠滑膜組織中的中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均能合成CAs[13]。本研究顯示對(duì)照組和CIA模型組淋巴結(jié)中存在Th17和Treg細(xì)胞各自的特異性核轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt和Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO的共定位細(xì)胞，提示CD4+T細(xì)胞亞群Th17和Treg細(xì)胞均可以合成、儲(chǔ)存和降解CAs。本研究中CIA模型組淋巴結(jié)中TH表達(dá)顯著升高，其他實(shí)驗(yàn)室的研究亦發(fā)現(xiàn)CIA模型組小鼠淋巴結(jié)、脾臟和關(guān)節(jié)中TH+細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組[14]。筆者最近的研究表明在CIA模型組小鼠的關(guān)節(jié)滑膜中CD4+T細(xì)胞TH的表達(dá)增加[11]。本研究表明CIA模型組淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞合成、儲(chǔ)存和降解CAs的能力顯著高于對(duì)照組，而CIA模型組Treg細(xì)胞合成、儲(chǔ)存和降解CAs的能力與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變，說(shuō)明CIA模型組淋巴結(jié)中增多的TH有部分是來(lái)自Th17細(xì)胞的作用。有研究報(bào)道，過(guò)繼轉(zhuǎn)移TH+細(xì)胞可以減輕CIA小鼠的癥狀，而6-羥基多巴可以清除TH+細(xì)胞，從而逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)[15]。關(guān)節(jié)局部注射利血平，可增加關(guān)節(jié)中細(xì)胞內(nèi)CAs的水平，也可緩解CIA模型組小鼠關(guān)節(jié)的炎癥癥狀[16]。在CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中，Th17細(xì)胞合成CAs的能力在模型Ⅱ組與模型Ⅰ組相比有所降低，這種現(xiàn)象與CIA中Th17/Treg細(xì)胞比例及致炎因子/抗炎因子失衡的緩解相平行。提示Th17細(xì)胞產(chǎn)生的CAs可能在CIA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有一定的抗炎作用，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上，CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的致炎效應(yīng)增強(qiáng)，而Treg的抗炎效應(yīng)減弱。同時(shí)，CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中TH的表達(dá)增加，這種增加有部分是來(lái)自Th17細(xì)胞的作用。Th17細(xì)胞合成CAs的能力與Th17/Treg功能失衡的緩和相平行，提示Th17細(xì)胞來(lái)源的CAs在CIA發(fā)病過(guò)程中有抗炎作用。

Fig.1 Co-expression of ROR-γt with TH,VMAT-2 or MAO in Th17 cells(×400)圖1 Th17細(xì)胞中ROR-γt分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的免疫熒光染色圖（×400）

Fig.2 Co-expression of Foxp3 with TH,VMAT-2 or MAO in Treg cells(×400)圖2 Treg細(xì)胞中Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的免疫熒光染色圖（×400）

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（2014-09-09收稿 2014-09-29修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Role of Catecholamines Derived from Th17 and Treg Cells in TypeⅡArthritis Induced by Collagen

WANG Xiaoqin,PENG Yuping,LIU Zhan,QIU Yihua△
Department of Physiology,School of Medicine,Nantong University,Nantong 226001,China
△

E-mail:yhqiu@ntu.edu.cn

ObjectiveTo explore the role of Th17-and Treg-derived catecholamines during collagen-induced arthritis(CIA)progression.MethodsEighteen male DBA/1 mice were randomly divided into control group,CIA model group Ⅰ(day 35)and CIA model groupⅡ(day 55).The CIA models were induced by typeⅡcollagen(CⅡ)injection from tails. mRNA expression of Th17 specific transcription factor include ROR-γt,cytokines,IL-17 IL-22,Treg specific transcription factor,Foxp3,cytokines,TGF-β and tyrosine hydroxylase(TH)in lymph nodes were examined by real-time PCR.Co-localization of ROR-γt or Foxp3,with TH,vesicular monoamine transporter-2(VMAT-2)or monoamine oxidase(MAO)in lymph nodes were observed by immunofluorescence staining.ResultsIn lymph nodes of mice in CIAⅠgroup and CIAⅡgroup, mRNA expression of ROR-γt,IL-17,TH and IL-22 were upregulated,while mRNA expression of Foxp3 and TGF-β expression was downregulated compared to those expression in control group.The upregulated expression of IL-17 was significantly reduced in CIAⅡgroup compared with that in CIAⅠgroup.In the lymph nodes of both intact and CIA mice,co-localization of ROR-γt or Foxp3 with TH,VMAT-2 or MAO was seen in some cells.The numbers of cells that are double-positive of ROR-γt/TH，ROR-γt/VMAT-2 and ROR-γt/MAO IL-17 were increased in CIA groups compared to those in control group.And they are significantly reduced in CIAⅡgroup compared with those in CIAⅠgroup.ConclusionThe ability to synthesize catecholamines in Th17 cells was increased in lymph node in mice from CIA groups compared to that in control group.The increased catecholamines production from Th17 cells in lymph nodes may be involved in the anti-inflammatory progression in CIA.

arthritis,rheumatoid;catecholamines;T-lymphocytes,regulatory;tyrosine 3-monooxygenase;Th17 cells;collagen-induced arthritis

R392

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.006

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371182）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13KJB310012）

南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系（郵編226001）

△通訊作者 E-mail:yhqiu@ntu.edu.cn