王小琴 彭聿平 劉 展 邱一華

實驗研究

Th17和Treg細胞來源的兒茶酚胺在膠原誘導性關節(jié)炎中的作用

王小琴 彭聿平 劉 展 邱一華△

目的 探討膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）疾病發(fā)生發(fā)展過程中Th17和Treg細胞來源的兒茶酚胺（CAs）的作用。方法隨機將18只雄性DBA/1小鼠分為對照組、CIA模型Ⅰ組（35 d）和CIA模型Ⅱ組（55 d）。Ⅱ型膠原乳劑尾根部注射制備CIA小鼠模型。Real-time PCR法檢測淋巴結(jié)中Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt，相關細胞因子IL-17和IL-22，Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，相關細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β以及酪氨酸羥化酶（TH）的mRNA表達。免疫熒光組織化學染色法觀察淋巴結(jié)中ROR-γt和Foxp3分別與TH、囊泡單胺轉(zhuǎn)運體-2 （VMAT-2）和單胺氧化酶（MAO）的共定位情況。結(jié)果與對照組相比，CIA模型Ⅰ組和模型Ⅱ組的小鼠淋巴結(jié)中ROR-γ、IL-17、TH和IL-22的mRNA表達增加；Foxp3和TGF-β的mRNA表達減少；其中模型Ⅱ組IL-17的mRNA表達與模型Ⅰ組相比有所降低。對照組和CIA模型Ⅰ組及模型Ⅱ組的小鼠淋巴結(jié)中存在ROR-γt和Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO的共定位細胞。CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中ROR-γt/TH、ROR-γt/VMAT-2和ROR-γt/ MAO雙陽性細胞數(shù)增加，模型Ⅱ組中的這些雙陽性細胞數(shù)與模型Ⅰ組相比有所減少。結(jié)論CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中Th17細胞合成CAs的能力增強，這種Th17細胞來源的CAs的增加可能在CIA的發(fā)生發(fā)展過程有一定的抗炎作用。

關節(jié)炎,類風濕；兒茶酚胺類；T淋巴細胞,調(diào)節(jié)性；酪氨酸單氧化酶；Th17細胞；膠原誘導性關節(jié)炎

兒茶酚胺（catecholamines,CAs）一直被認為主要由神經(jīng)細胞和內(nèi)分泌細胞合成和分泌。近年來研究發(fā)現(xiàn)免疫細胞也能合成CAs[1]。筆者前期研究顯示淋巴細胞能夠表達合成CAs的限速酶酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）[2]。淋巴細胞來源的CAs對T淋巴細胞的增殖、凋亡及分化起調(diào)節(jié)作用[3-5]。類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以關節(jié)慢性滑膜炎為主的自身免疫性疾病[6]。膠原誘導性關節(jié)炎（collagen induced arthritis,CIA）是當前研究RA較理想和最為常用的動物模型。雖然RA的發(fā)病機制不是十分明確，但有研究表明CD4+T細胞在RA致病機制中具有重要作用[7]。傳統(tǒng)觀點認為CD4+T細胞分為Th1和Th2細胞2個細胞亞群。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Th17和Treg細胞也是CD4+T細胞的2個重要亞群[8]。Th17細胞主要分泌白細胞介素（IL）-17和IL-22，其特異性轉(zhuǎn)錄因子是ROR-γt；Treg細胞主要分泌轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β，其特異性轉(zhuǎn)錄因子是Foxp3。RA患者滑膜液及滑膜組織中被發(fā)現(xiàn)存在IL-17，Treg細胞作為免疫調(diào)節(jié)細胞成為RA的治療措施之一亦有報道[9-10]。筆者最近研究發(fā)現(xiàn)，CIA小鼠滑膜組織中CD4+T能夠合成CAs，且具有一定的抗炎作用[11]。本研究借助CIA小鼠模型，探討淋巴組織中Th17和Treg細胞能否合成CAs，以及Th17和Treg細胞來源的CAs在CIA中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級近交系DBA/1小鼠18只,8～10周齡,購于上海斯萊克實驗動物有限公司，采用抽簽法將動物隨機分為正常對照組和CIA模型Ⅰ組（35 d）和CIA模型Ⅱ組（55 d）。

1.2 主要試劑 小鼠抗ROR-γt、Foxp3、囊泡單胺轉(zhuǎn)運體-2 （VMAT-2）和單胺氧化酶（MAO）抗體均購于Santa cruz公司；小鼠抗TH抗體購于Millipore公司；雞Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ,CⅡ）購于Sigma公司；弗氏完全佐劑（CFA）購于Chondrex公司；脂多糖（LPS）購于Sigma公司。FITC羊抗小鼠抗體購自Sigma公司；羅丹明標記羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 CIA模型制備 等體積CFA與在0.1 mol/L冰醋酸中溶解的CⅡ（2 g/L）混合，充分乳化制成膠原乳劑。在小鼠尾根部多點皮下注射0.1 mL膠原乳劑，初次免疫后21 d在腹腔注射該膠原乳劑0.1 mL加強免疫，28 d腹腔注射LPS 20 μg加速關節(jié)炎發(fā)生。從加強免疫后開始,每隔2 d對每只小鼠4個足爪進行評分，直至初次免疫后55 d為止。關節(jié)炎分級評估：0分，所有的關節(jié)無任何紅腫；1分，輕度的紅和（或）腫；2分，顯著的紅腫；3分，關節(jié)僵硬或運動受限。每只小鼠4個足爪均評分，最高分為12分。

1.4 Real-time PCR法檢測mRNA表達 取各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)，提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再進行實時PCR擴增。引物由Invitrogen生物技術(shù)公司合成，序列見表1。PCR反應條件：94℃5 min預變性，95℃20 s，61℃20 s，72℃20 s，循環(huán)40次。

Tab.1 The primer sequences表1 引物序列

1.5 免疫熒光組織化學染色 初次免疫后35 d或55 d，對小鼠進行腹腔麻醉后，灌注、固定、取腸系膜淋巴結(jié)進行冰凍切片，片厚25 μm,加山羊血清封閉30 min，加入ROR-γt抗體后分別加入TH、VMAT-2或MAO抗體；或者加入Foxp3抗體后分別加入TH、VMAT-2或MAO抗體。4℃孵育過夜，加入FITC標記的羊抗小鼠和羅丹明標記的羊抗兔二抗，室溫孵育4 h，PBS漂洗，甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。隨機讀取5個視野進行照相,取5張片子，然后統(tǒng)計所有切片中陽性細胞數(shù)總數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間多重比較用采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠淋巴結(jié)中Th17和Treg細胞相關基因檢測結(jié)果 CIA模型組淋巴結(jié)中ROR-γt、IL-17及IL-22 mRNA的表達較對照組增高，IL-17 mRNA的表達在CIA模型Ⅱ組較CIA模型Ⅰ組明顯降低（均P＜0.05）。ROR-γt和IL-22的表達在2個模型組間差異無統(tǒng)計學意義。CIA模型Ⅰ組淋巴結(jié)中Foxp3 mRNA的表達與對照組相比無明顯變化，CIA模型Ⅱ組較對照組明顯降低。CIA模型組TGF-β的表達與對照組相比顯著降低，但2個模型組間差異無統(tǒng)計學意義。CIA模型組TH mRNA表達與對照組相比明顯增加，但2個模型組間差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2 Gene expression level in lymph nodes of mice from each group表2 各組小鼠淋巴結(jié)中各基因表達的變化(n=3,±s)

Tab.2 Gene expression level in lymph nodes of mice from each group表2 各組小鼠淋巴結(jié)中各基因表達的變化(n=3,±s)

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CIA模型Ⅰ組比較，P＜0.05

組別對照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F ROR-γt 1 4.53±0.52a3.53±0.50a19.170＊＊IL-17 1 7.89±0.75a4.33±0.95ab72.703＊＊IL-22 1 2.68±0.53a2.26±0.22a20.974＊＊組別對照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F Foxp3 1 0.90±0.05 0.80±0.12a6.028＊TGF-β 1 0.53±0.15a0.74±0.06a18.169＊＊TH 1 1.83±0.19a1.87±0.20a9.211＊

2.2 淋巴結(jié)中的 Th17細胞合成、儲存和降解CAs 對照組和CIA模型組淋巴結(jié)中均有ROR-γt分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的雙陽性細胞存在，即Th17細胞能夠合成、儲存、降解CAs，見圖1。CIA模型組淋巴結(jié)中 ROR-γt/TH、ROR-γt/ VMAT-2、ROR-γt/MAO共定位的雙陽性細胞數(shù)均多于對照組，且模型Ⅱ組的ROR-γt/TH和ROR-γt/ MAO共定位的雙陽性細胞數(shù)與模型Ⅰ組相比顯著降低（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Number of Double-positive cell in lymph nodes from mice in each group表3 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽性細胞數(shù)（n=3,±s）

Tab.3 Number of Double-positive cell in lymph nodes from mice in each group表3 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽性細胞數(shù)（n=3,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CIA模型Ⅰ組比較，P＜0.05；表3同

組別對照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F ROR-γt/TH 23.0±3.6 40.3±3.2a33.0±3.0ab21.072＊＊ROR-γt/VMAT-2 30.7±4.5 57.7±10.0a46.0±7.0a9.727＊ROR-γt/MAO 32.3±4.5 61.0±4.4a48.3±5.1ab28.284＊＊

2.3 淋巴結(jié)中Treg細胞能夠表達TH、VMAT-2和MAO 對照組和CIA模型組淋巴結(jié)中均有Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的雙陽性細胞存在，即Treg細胞能夠合成、儲存、降解CAs，見圖2。3組間Foxp3/TH、Foxp3/VMAT-2、Foxp3/MAO共定位的雙陽性細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義，見表4。

Tab.4 Number of Double-positive cell in lymph nodes of mice from each group表4 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽性細胞數(shù) （n=3,±s）

Tab.4 Number of Double-positive cell in lymph nodes of mice from each group表4 各組小鼠淋巴結(jié)中雙陽性細胞數(shù) （n=3,±s）

組別對照組CIA模型Ⅰ組CIA模型Ⅱ組F Foxp3/TH 23.7±3.1 25.7±3.1 25.0±1.0 0.475 Foxp3/VMAT-2 26.3±3.5 31.0±4.6 29.0±4.6 0.908 Foxp3/MAO 30.3±4.2 34.3±4.5 33.0±3.5 0.752

3 討論

RA以慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕卣?，是一種可累及全身的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其病因不是十分明確，與多種因素有關。有學者認為CD4+T細胞在RA的發(fā)病機制中有著重要的作用[7]。Th17和Treg細胞是CD4+T細胞中2個重要的亞群。有研究報道，RA患者外周血存在致炎細胞因子/抗炎細胞因子失衡及Th17/Treg的細胞比例失調(diào)的現(xiàn)象[12]。本研究中顯示CIA模型組小鼠的淋巴結(jié)中Th17細胞的ROR-γt mRNA表達增加，而Treg細胞的Foxp3 mRNA表達與對照組相比有所降低，說明CIA模型組淋巴結(jié)中存在Th17/ Treg細胞比例失調(diào)。此外，CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中致炎細胞因子IL-17和IL-22 mRNA的表達增加，而抗炎細胞因子TGF-β mRNA表達減少，說明CIA模型組的淋巴結(jié)中存在細胞因子/抗炎細胞因子的失衡。這種細胞比例及致炎/抗炎細胞因子的失衡在模型組（55 d）得到一定程度的緩和。

CIA小鼠滑膜組織中的中性粒細胞、B細胞、巨噬細胞均能合成CAs[13]。本研究顯示對照組和CIA模型組淋巴結(jié)中存在Th17和Treg細胞各自的特異性核轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt和Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO的共定位細胞，提示CD4+T細胞亞群Th17和Treg細胞均可以合成、儲存和降解CAs。本研究中CIA模型組淋巴結(jié)中TH表達顯著升高，其他實驗室的研究亦發(fā)現(xiàn)CIA模型組小鼠淋巴結(jié)、脾臟和關節(jié)中TH+細胞數(shù)顯著高于對照組[14]。筆者最近的研究表明在CIA模型組小鼠的關節(jié)滑膜中CD4+T細胞TH的表達增加[11]。本研究表明CIA模型組淋巴結(jié)中Th17細胞合成、儲存和降解CAs的能力顯著高于對照組，而CIA模型組Treg細胞合成、儲存和降解CAs的能力與對照組相比無明顯改變，說明CIA模型組淋巴結(jié)中增多的TH有部分是來自Th17細胞的作用。有研究報道，過繼轉(zhuǎn)移TH+細胞可以減輕CIA小鼠的癥狀，而6-羥基多巴可以清除TH+細胞，從而逆轉(zhuǎn)上述反應[15]。關節(jié)局部注射利血平，可增加關節(jié)中細胞內(nèi)CAs的水平，也可緩解CIA模型組小鼠關節(jié)的炎癥癥狀[16]。在CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中，Th17細胞合成CAs的能力在模型Ⅱ組與模型Ⅰ組相比有所降低，這種現(xiàn)象與CIA中Th17/Treg細胞比例及致炎因子/抗炎因子失衡的緩解相平行。提示Th17細胞產(chǎn)生的CAs可能在CIA發(fā)生發(fā)展過程中有一定的抗炎作用，具體的作用機制有待進一步研究闡明。

綜上，CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中Th17細胞的致炎效應增強，而Treg的抗炎效應減弱。同時，CIA模型組小鼠淋巴結(jié)中TH的表達增加，這種增加有部分是來自Th17細胞的作用。Th17細胞合成CAs的能力與Th17/Treg功能失衡的緩和相平行，提示Th17細胞來源的CAs在CIA發(fā)病過程中有抗炎作用。

Fig.1 Co-expression of ROR-γt with TH,VMAT-2 or MAO in Th17 cells(×400)圖1 Th17細胞中ROR-γt分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的免疫熒光染色圖（×400）

Fig.2 Co-expression of Foxp3 with TH,VMAT-2 or MAO in Treg cells(×400)圖2 Treg細胞中Foxp3分別與TH、VMAT-2和MAO共定位的免疫熒光染色圖（×400）

[1]Laukova M,Vargovic P,Vlcek M,et al.Catecholamine production is differently regulated in splenic T-and B-cells following stress exposure[J].Immunobiology,2013,218(5):780-789.

[2]Qiu YH,Peng YP,Jiang JM,et al.Expression of tyrosine hydroxylase in lymphocytes and effect of endogenous catecholamines on lymphocyte function[J].Neuroimmunomodulation,2004,11(2):75-83.

[3]Qiu YH,Cheng C,Dai L,et al.Effect of endogenous catecholamines in lymphocytes on lymphocyte function[J].Neuroimmunology,2005, 167(1-2):45-52.

[4]Jiang JL,Peng YP,Qiu YH,et al.Effect of endogenous catecholamines on apoptosis of Con A-activated lymphocytes of rats[J]. Neuroimmunology,2007,192(1-2):79-88.

[5]Huang HW,Tang JL,Han XH,et al.Lymphocyte-derived catecholamines induce a shift of Th1/Th2 balance toward Th2 polarization [J].Neuroimmunomodulation,2013,20(1):1-8.

[6]Firestein GS.Evolving concepts of rheumatoid arthritis[J].Nature, 2003,423(6937):356-361.

[7]Fournier C.Where do T cells stand in rheumatoid arthritis[J]?Joint Bone Spine,2005,72(6):527-532.

[8]Noack M,Miossec P.Th17 and regulatory T cell balance in autoimmune and in fl ammatory diseases[J].Autoimmu Rev,2014,13(6): 668-677.

[9]Volpe E,Servant N,Zollinger R,et al.A critical function for transforming growth factor-beta,interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human T(H)-17 responses[J].Nat Immunol,2008,9(6):650-657.

[10]Sarkar S,Fox DA.Regulatory T cell defects in rheumatoid arthritis [J].Arthritis Rheum,2007,56(3):710-713.

[11]Zhao XY,Cui SW,Wang XQ,et al.Tyrosine hydroxylase expression in CD4+T cells is associated with joint inflammatory alleviation in collagen type II-induced arthritis[J].Rheumatol Int,2013, 33(10):2597-2605.

[12]Wang WH,Shao SH,Jiao ZJ,et al.The Th17/Treg imbalance and cytokine environment in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Int,2012,32(4):887-893.

[13]Capellino S,Weber K,Gelder M,et al.First appearance and location of catecholaminergic cells during experimental arthritis and elimination by chemical sympathectomy[J].Arthritis Rheum,2012, 64(4):1110-1118.

[14]Monari C,Bevilacqua S,Piccioni M,et al.A microbial polysaccharide reduces the severity of rheumatoid arthritis by influencing Th17 differentiation and proinflammatory cytokines production[J].J Immunol,2009,183(1):191-200.

[15]Capellino S,Cosentino M,Wolff C,et al.Catecholamine-producing cells in the synovial tissue during arthritis:modulation of sympathetic neurotransmitters a new therapeutic target[J].Ann Rheum Dis, 2010,69(10):1853-1860.

[16]Jenei-Lanzl Z,Capellino S,Kees F,et al.Anti-inflammatory effects of cell-based therapy with tyrosine hydroxylase-positive catecholaminergic cells in experimental arthritis[J].Ann Rheum Dis,2013, Dec 2.doi:10.1136/annrheumdis-2013-203925.[Epub ahead of print]

（2014-09-09收稿 2014-09-29修回）

（本文編輯 李國琪）

Role of Catecholamines Derived from Th17 and Treg Cells in TypeⅡArthritis Induced by Collagen

WANG Xiaoqin,PENG Yuping,LIU Zhan,QIU Yihua△
Department of Physiology,School of Medicine,Nantong University,Nantong 226001,China
△

E-mail:yhqiu@ntu.edu.cn

ObjectiveTo explore the role of Th17-and Treg-derived catecholamines during collagen-induced arthritis(CIA)progression.MethodsEighteen male DBA/1 mice were randomly divided into control group,CIA model group Ⅰ(day 35)and CIA model groupⅡ(day 55).The CIA models were induced by typeⅡcollagen(CⅡ)injection from tails. mRNA expression of Th17 specific transcription factor include ROR-γt,cytokines,IL-17 IL-22,Treg specific transcription factor,Foxp3,cytokines,TGF-β and tyrosine hydroxylase(TH)in lymph nodes were examined by real-time PCR.Co-localization of ROR-γt or Foxp3,with TH,vesicular monoamine transporter-2(VMAT-2)or monoamine oxidase(MAO)in lymph nodes were observed by immunofluorescence staining.ResultsIn lymph nodes of mice in CIAⅠgroup and CIAⅡgroup, mRNA expression of ROR-γt,IL-17,TH and IL-22 were upregulated,while mRNA expression of Foxp3 and TGF-β expression was downregulated compared to those expression in control group.The upregulated expression of IL-17 was significantly reduced in CIAⅡgroup compared with that in CIAⅠgroup.In the lymph nodes of both intact and CIA mice,co-localization of ROR-γt or Foxp3 with TH,VMAT-2 or MAO was seen in some cells.The numbers of cells that are double-positive of ROR-γt/TH，ROR-γt/VMAT-2 and ROR-γt/MAO IL-17 were increased in CIA groups compared to those in control group.And they are significantly reduced in CIAⅡgroup compared with those in CIAⅠgroup.ConclusionThe ability to synthesize catecholamines in Th17 cells was increased in lymph node in mice from CIA groups compared to that in control group.The increased catecholamines production from Th17 cells in lymph nodes may be involved in the anti-inflammatory progression in CIA.

arthritis,rheumatoid;catecholamines;T-lymphocytes,regulatory;tyrosine 3-monooxygenase;Th17 cells;collagen-induced arthritis

R392

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.006

國家自然科學基金資助項目（31371182）；江蘇省高校自然科學研究項目（13KJB310012）

南通大學醫(yī)學院生理學系（郵編226001）

△通訊作者 E-mail:yhqiu@ntu.edu.cn