張黎黎張潔張林于洋劉堃△

臨床研究

p53、bcl-2、caspase-3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

張黎黎1張潔2張林1于洋3劉堃1△

目的探討p53、bcl-2、caspase-3在老年晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)及相關(guān)性。方法收集經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查確診的117例老年晚期NSCLC患者的臨床資料和存檔石蠟組織標(biāo)本。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中p53、bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)情況，分析p53、bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性及其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果117例老年晚期NSCLC組織標(biāo)本中，p53、bcl-2、caspase-3的陽性表達(dá)率分別為42.74％（50/117）、38.46％（45/117）、36.75％（43/117）。p53陽性表達(dá)率在低分化、中央型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌患者中較高；bcl-2陽性表達(dá)率在高分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中較高；caspase-3陽性表達(dá)率在高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中較高。NSCLC組織中bcl-2與caspase-3表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.262,P=0.003）。結(jié)論p53、bcl-2、caspase-3可能在老年晚期NSCLC的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用，為臨床病理診斷提供理論依據(jù)。

腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53；原癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；癌,非小細(xì)胞肺；老年人；非小細(xì)胞肺癌

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其預(yù)后較差，5年生存率較低[1]。80％以上的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）[2]，其中約一半發(fā)生在65歲以上的老年人，而且2/3的NSCLC患者在確診時(shí)已是惡性程度較高的ⅢB或Ⅳ期[3]。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，在這一過程中主要起負(fù)調(diào)控作用的是細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡的過程受p53等凋亡促進(jìn)因子和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)等凋亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。而天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族在細(xì)胞凋亡階段起重要作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)117例老年晚期NSCLC腫瘤組織中p53、bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)進(jìn)行綜合檢測(cè)，探討3種蛋白表達(dá)情況的相關(guān)性及其與NSCLC臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2007年2月—2008年2月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的由術(shù)后病理學(xué)檢查確診的117例老年晚期NSCLC患者資料及存檔石蠟組織標(biāo)本。其中，男80例（68.38％），女37例（31.62％）。年齡60～76歲，平均年齡（64.87±3.73）歲。有吸煙史60例（51.28％），無吸煙史57例（48.72％）。臨床分期：Ⅲ期63例（53.85％），Ⅳ期54例（46.15％）。病理類型：鱗癌47例（40.17％），腺癌52例（44.44％），腺鱗癌3例（2.56％），大細(xì)胞癌5例（4.27％），其他10例（8.55％）。分化程度：低分化43例（36.75％），中分化51例（43.59％），高分化23例（19.66％）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例（52.99％），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例（47.01％）。腫瘤部位：中央型60例（51.28％），周圍型57例（48.72％）。

1.2 主要試劑兔抗人CPP-32多克隆抗體（濃縮型1∶50稀釋）、兔抗人p53單克隆抗體（濃縮型1∶100稀釋）、兔抗人bcl-2單克隆抗體（1∶100稀釋）、S-P試劑盒、DAB顯示試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本經(jīng)連續(xù)石蠟切片（4 μm），免疫組化技術(shù)采用SP法,用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，用已知的陽性病例作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定以半定量法判定結(jié)果。p53主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞核，caspase-3主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿，bcl-2主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿，陽性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色顆粒。每例標(biāo)本隨機(jī)讀取5個(gè)不同高倍視野（各計(jì)100個(gè)細(xì)胞），計(jì)算腫瘤細(xì)胞中p53、bcl-2和caspase-3表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：0～5％為0分，6％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％ 為3分，＞75％為4分。再按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃/棕褐色為3分。兩者之和所得總分進(jìn)行判斷，0～2分為陰性（-），3～7分為陽性（+）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman進(jìn)行等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1p53、bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：NSCLC組織中p53、bcl-2和caspase-3的陽性表達(dá)率分別為42.74％（50/117）、38.46％（45/117）、36.75％（43/117），見圖1。

Fig.1 Expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 in NSCLC tissues （SP,×400）圖1 NSCLC組織中p53、bcl-2、caspase-3的表達(dá)（SP,×400）

2.2p53、bcl-2和caspase-3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。NSCLC組織中，低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中p53陽性表達(dá)率高于高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；中央型、鱗癌患者腫瘤組織中p53陽性表達(dá)率明顯高于周圍型、其他病理分型患者（P＜0.05），不同性別、吸煙史、臨床分期的NSCLC患者組織中p53陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NSCLC組織中，高分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中bcl-2陽性表達(dá)率高于低分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；不同性別、吸煙史、腫瘤部位、臨床分期、病理類型的NSCLC患者組織中bcl-2陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NSCLC組織中，高分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中caspase-3陽性表達(dá)率高于低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；不同性別、吸煙史、腫瘤部位、臨床分期、病理類型的NSCLC患者組織中caspase-3陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3NSCLC患者腫瘤組織p53、bcl-2和caspase-3表達(dá)的相關(guān)性NSCLC組織中，p53與bcl-2、caspase-3表達(dá)無明顯相關(guān)性，bcl-2與caspase-3表達(dá)呈顯著正相關(guān)，見表2～4。

Tab.1 Relationship between expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 with clinicopathological characteristics of NSCLC tissues表1 p53、bcl-2和caspase-3的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系例（％）

Tab.2 Relationship between expressions of p53 and bcl-2 in NSCLC tissues表2 NSCLC組織中p53和bcl-2表達(dá)的相關(guān)性

Tab.3 Relationship between expressions of p53 and caspase-3 in NSCLC tissues表3 NSCLC組織中p53和caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

Tab.4 Relationship between expressions of bcl-2 and caspase-3 in NSCLC tissues表4 NSCLC組織中bcl-2和caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

肺癌已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥[4]。我國已逐漸成為老齡化國家，且老年肺癌的發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)。經(jīng)研究證實(shí)，肺癌的發(fā)生與抑癌基因的失活及原癌基因的激活有關(guān)。p53是目前公認(rèn)的抑癌基因，機(jī)體內(nèi)最重要的抑癌基因?yàn)橐吧蚿53基因，且大約50％以上的人類腫瘤有p53基因的缺失和突變。因此，一些腫瘤的發(fā)生是p53基因的缺失或突變所致。然而，p53基因突變譜的不同可能使肺癌的易感性及相應(yīng)腫瘤的形成受到影響。Bcl-2是原癌基因，它可以抑制許多凋亡信號(hào)從而影響細(xì)胞的凋亡，并協(xié)助細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視作用，且與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Bcl-2基因定位于人染色體的18q21，由230 kb組成，含有3個(gè)外顯子，在正常情況下不表達(dá)或低表達(dá)。由于凋亡細(xì)胞的減少，細(xì)胞數(shù)目相應(yīng)增多，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡的平衡打破，并且細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化可能性增大，進(jìn)而形成腫瘤。研究證實(shí)，bcl-2基因是凋亡抑制基因，可異常延長細(xì)胞的生存時(shí)間，促進(jìn)有轉(zhuǎn)化作用的基因突變。caspase-3是caspase家族中最重要的成員，是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者。細(xì)胞凋亡最終均需caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。caspase-3蛋白與肺癌關(guān)系密切。黃凱等[5]研究表明，在NSCLC中caspase-3基因可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的作用。

研究表明，不同的p53基因突變譜可能使肺癌的易感性及相應(yīng)腫瘤的形成受影響，突變型p53蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率為30％～65％[6]。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌p53的陽性表達(dá)率為42.74％，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相近[7-8]。本研究中，NSCLC組織中p53陽性表達(dá)率在低分化、中央型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌患者中較高。非小細(xì)胞肺癌bcl-2的陽性表達(dá)率為38.46％，與文獻(xiàn)報(bào)道相近[9]，而與Qin等[10]的研究結(jié)果相差較大。其結(jié)果不一致可能是由于本組患者均為60歲以上的NSCLC晚期患者，且該群體為特殊人群，與Qin等[10]所研究的群體不同；還可能由于老年晚期NSCLC的腫瘤細(xì)胞對(duì)bcl-2蛋白的敏感性與其他人群有差異。NSCLC組織中bcl-2陽性表達(dá)率均在高分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中較高。非小細(xì)胞肺癌的caspase-3陽性表達(dá)率為36.75％，與文獻(xiàn)報(bào)道相近[11-12]。趙陽等[12]研究表明，caspase-3隨著肺癌分化程度越高而表達(dá)越高。本研究結(jié)果示NSCLC組織中caspase-3陽性表達(dá)率在高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中較高，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[12]。提示caspase-3蛋白表達(dá)的缺失與肺癌淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。有caspase-3蛋白表達(dá)缺失的肺癌患者易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與肺癌的發(fā)展有關(guān)。在老年晚期NSCLC組織中，bcl-2與caspase-3表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

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（2013-09-03收稿2014-03-12修回）

（本文編輯魏杰）

Correlation Analysis between Expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer

ZHANG Lili1,ZHANG Jie2,ZHANG Lin1,YU Yang3,LIU Kun1
1 School of Nursing College,Liaoning Medical University,Liaoning 121000,China；2 The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University；3 The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University LIU Kun,E-mail：522177601@qq.com

ObjectiveTo investigate the expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 in elderly patients with advanced non-small cell lung cancer(NSCLC),and the clinical significance thereof.MethodsThe clinical data and paraffin tissue samples of 117 patients with NSCLC confirmed by postoperative pathology were collected.The expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 protein in tissues of NSCLC were detected by immunohistochemical method.The correlation between the expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 protein was analyzed,and the relationship between the expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 protein and clinicopathological characteristics was explored.ResultsThe positive expression rates of p53,bcl-2 and caspase-3 were 42.74％(50/117),38.46％(45/117)and 36.75％(43/117)in tissue samples of NSCLC.The positive expression rate of p53 was significantly higher in patients with poor differentiation,central type,lymph node metastasis and squamous carcinoma.The positive expression rate of bcl-2 was significantly higher in patients with high differentiation and lymph node metastasis.The positive expression rate of caspase-3 was significantly higher in patients with high differentiation and no lymph node metastasis.There was a positive correlation between expressions of bcl-2 and caspase-3 in NSCLC (r=0.262,P=0.003).ConclusionThe expressions of p53,bcl-2 and caspase-3 may play important roles in development and progression of advanced NSCLC in elderly patients,which may serve as predicators for prognosis.

tumor suppressor protein p53;proto-oncogene protein c-bcl-2;caspase 3;carcinoma,non-small-cell lung;aged;NSCLC

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.013

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2012225019）

1遼寧錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院（郵編121000）；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院;3遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院△

E-mail：522177601@qq.com