鄭君毅 王霽翔 肖健勇 叢洪良

微小RNA-1在缺氧心肌細(xì)胞凋亡中的作用

鄭君毅 王霽翔 肖健勇 叢洪良△

目的研究微小RNA（miR）-1在缺氧心肌細(xì)胞凋亡中的作用。方法將培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞分為5組，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、H2O2組、miR-1組和H2O2+miR-1組。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法證實(shí)miR-1轉(zhuǎn)染成功后，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞存活率和凋亡情況，用PCR和Western Blot的方法檢測(cè)抗凋亡因子bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組各個(gè)指標(biāo)的變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他3組細(xì)胞的miR-1表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率下降，凋亡率增加，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低。結(jié)論微小RNA-1可通過(guò)降低抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)水平誘導(dǎo)缺氧心肌細(xì)胞的凋亡。

微RNAs；缺氧；肌細(xì)胞，心臟；細(xì)胞凋亡；miR-1

微小RNA（microRNA，miR）是一類(lèi)長(zhǎng)18～25 nt的小分子單鏈非編碼RNA。它們?cè)谏矬w內(nèi)高度保守，具有調(diào)節(jié)作用，可通過(guò)特異性識(shí)別靶mRNA的 3′非編碼區(qū)（3′-UTR），抑制靶mRNA的蛋白表達(dá)或者直接降解靶mRNA調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白質(zhì)的水平，人類(lèi)約30％的基因受到miR的調(diào)節(jié)[1-2]。miR-1是心肌細(xì)胞中含量最高的miR，具有調(diào)控心肌細(xì)胞分化、維持心臟功能的重要作用[3]，并且參與心肌肥厚[4]、心肌梗死和心律失常[5]以及血管病變等病理生理變化過(guò)程。心肌缺氧是各種心臟疾病共同的病理?yè)p害，可引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心肌壞死、炎癥、病理改變、左心室功能障礙等。本實(shí)驗(yàn)在心肌細(xì)胞缺氧模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-1 mimic片段，觀察miR-1的含量與細(xì)胞凋亡的情況，并通過(guò)研究抗凋亡基因Bcl-2的mRNA和蛋白水平變化，探討miR-1在缺氧心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器H9C2大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。Lipofectamine 2000（轉(zhuǎn)染試劑）、Trizol（RNA提取試劑）、M-MLV（逆轉(zhuǎn)錄酶）、RNase Inhibitor(RNA酶抑制劑)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成miR-1 mimic和miRNA陰性對(duì)照片段。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、一抗bcl-2、β-actin和二抗購(gòu)自天津聯(lián)星生物公司?？偟鞍滋崛≡噭┖泻虰CA蛋白定量試劑盒為北京索來(lái)寶公司產(chǎn)品。凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品。電泳系統(tǒng)和PCR儀為伯樂(lè)公司產(chǎn)品。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組H9C2大鼠心肌細(xì)胞株在高糖DMEM培養(yǎng)基（含10％FBS）中，置于37℃培養(yǎng)箱中，5％CO2條件下濕潤(rùn)培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照組：H9C2細(xì)胞培養(yǎng)條件不做任何改變；陰性對(duì)照組：H9C2細(xì)胞轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成的miRNA陰性對(duì)照片段；H2O2組：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為0.4 mmol/L的H2O2，持續(xù)培養(yǎng)48 h；miR-1組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1 mimic片段；H2O2+miR-1組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1 mimic片段后，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為0.4 mmol/L的H2O2。于48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 各組細(xì)胞中miR-1的水平根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后-20℃冰箱保存進(jìn)行miR-1水平的檢測(cè)，U6作為內(nèi)參。miR-1引物上游5′-CGGCGGTGGAATGTAAAGAAGT-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件為：變性95℃10 min；95℃15 s，60℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；延伸72℃5 min。根據(jù)公式2-△Ct計(jì)算得到實(shí)驗(yàn)觀察值（△Ct=Ct1-Ct2，Ct1：樣品待測(cè)基因的臨界循環(huán)數(shù)；Ct2：樣品內(nèi)參基因的臨界循環(huán)數(shù)），用以表示起始模板濃度，并以此值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，向各組細(xì)胞中加入20μL MTT（5 g/L），37℃孵育4 h。輕輕吸凈各孔液體，加入150μL DMSO，置于水平搖床上使結(jié)晶充分溶解。待結(jié)晶完全溶解后，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度（A）值。以正常對(duì)照組的細(xì)胞生存率為100％，計(jì)算各組細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率（％）=實(shí)驗(yàn)組A值/正常對(duì)照組A值×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡48 h后，吸凈各組細(xì)胞培養(yǎng)液，加入胰酶消化至細(xì)胞形態(tài)為圓形時(shí)，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清。將細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次，并重懸于binding buffer中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，向細(xì)胞懸液中加入熒光標(biāo)記的Annexin V和PI試劑，避光孵育15 min，然后加入binding buffer，1 h之內(nèi)上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 各組bcl-2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄操作同上。目的基因Bcl-2和內(nèi)參基因β-actin的引物均由北京Invitrogen生物公司合成。bcl-2引物上游5′-GGGAGATCGTGATGAAGTAC-3′，下游5′-GGAA GGAGAAGATGCCAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為120 bp；β-actin引物上游5′-GAACCCTAAGGCCAACCGTG-3′，下游5′-AGGCATACAGGGACAACACAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為105 bp。PCR條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火45 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 各組bcl-2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)根據(jù)說(shuō)明書(shū)，提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。調(diào)整蛋白濃度至5 g/L，取8μL總蛋白上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后將膜放入5％奶粉中封閉2 h，按照1∶500和1∶1 000的比例分別加入一抗bcl-2和β-actin，置于4℃搖床上孵育過(guò)夜。然后TBST洗膜3次，加入1∶500的二抗室溫孵育2 h。吸凈液體，加入1 mL發(fā)光液，于成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描。bcl-2蛋白條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示樣本中bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 11.5錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況，如符合則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中miR-1的水平正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組miR-1基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3組miR-1基因的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of data between five groups表1 各組細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of data between five groups表1 各組細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別正常對(duì)照組陰性對(duì)照組H2O2組miR-1組H2O2+miR-1組F miR-1 0.66±0.14 0.71±0.16 2.34±0.74a3.46±1.28a4.53±1.31a10.969＊＊細(xì)胞生存率（％）100.00±8.61 97.87±10.21 52.82±9.98a45.69±8.13a35.28±8.53a66.568＊＊細(xì)胞凋亡率（％）3.13±0.45 3.33±0.70 12.03±1.15a15.70±2.82a28.60±0.60a160.552＊＊組別正常對(duì)照組陰性對(duì)照組H2O2組miR-1組H2O2+miR-1組F bcl-2 mRNA 2.38±0.13 2.39±0.15 1.82±0.11a1.45±0.08a0.94±0.24a50.254＊＊蛋白0.95±0.05 0.94±0.11 0.68±0.12a0.50±0.10a0.28±0.10a26.208＊＊

2.2MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生存率陰性對(duì)照組細(xì)胞生存率與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入H2O248 h后，細(xì)胞生存率較正常對(duì)照組下降（P＜0.01），轉(zhuǎn)染miR-1 mimic片段或轉(zhuǎn)染miR-1 mimic片段后加入H2O2使細(xì)胞的生存率進(jìn)一步降低（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其他3組細(xì)胞凋亡明顯，H2O2+miR-1組細(xì)胞凋亡率最高，見(jiàn)表1、圖1。

2.4 各組bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組抗凋亡基因bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其他3組bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖2。

3 討論

近年來(lái)，miRNA在心血管疾病中的調(diào)控作用已成為研究的熱點(diǎn)，尤其在心肌缺血性損傷中，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。Dong等[6]發(fā)現(xiàn)，冠脈閉塞6 h后，與非缺血區(qū)域相比，缺血區(qū)域38個(gè)miRNA發(fā)生了改變，其中21個(gè)上調(diào)17個(gè)下調(diào)；缺血邊緣區(qū)域33個(gè)miRNA發(fā)生了改變，其中19個(gè)上調(diào)14個(gè)下調(diào)。Roy等[7]研究了C57BL/6小鼠的缺血再灌注模型中microRNA表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)再灌注2 d后，13個(gè)miRNA發(fā)生了上調(diào)，而再灌注7 d后，9個(gè)miRNA發(fā)生了上調(diào)，但是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都是6個(gè)miRNA發(fā)生了下調(diào)。這不僅說(shuō)明miRNA參與了心血管疾病的病理生理過(guò)程，而且不同的心臟疾病miRNA表達(dá)譜的變化是不同的。

Fig.1 The apoptotic rate of cells in five groups圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

Fig.2 Results of bcl-2 protein levels detected by Western blot assay圖2 Western Blot檢測(cè)不同組bcl-2蛋白表達(dá)水平

在這些變化的miRNA中，miR-1被認(rèn)為最具有心肌特異性，但對(duì)于其作用機(jī)制仍不清楚，甚至出現(xiàn)了相反的研究結(jié)果。Xu等[8]通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)將體外合成的miR-1 mimic導(dǎo)入心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-1的心肌細(xì)胞Caspase3活性升高、出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-1可以降低熱休克蛋白60/70的蛋白表達(dá)水平（此兩者為心肌細(xì)胞重要的抗凋亡因子），從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡主要涉及兩條信號(hào)通路，一條是死亡受體通路；一條是線(xiàn)粒體信號(hào)通路，即線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡中處于樞紐地位，各種凋亡刺激信號(hào)引起線(xiàn)粒體腫脹、膜流動(dòng)性降低、通透性增加，從而釋放細(xì)胞色素C（cytC）等凋亡誘導(dǎo)因子，啟動(dòng)Caspase蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。bcl-2家族是線(xiàn)粒體凋亡途徑中最重要的一組凋亡基因，其中bcl-2是這個(gè)家族中最重要的抗凋亡基因，通過(guò)抑制細(xì)胞死亡調(diào)控細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。本研究用microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件targetscan和miRBase預(yù)測(cè)到bcl-2為miR-1作用的一個(gè)靶基因。為了進(jìn)一步研究miR-1在缺血心肌細(xì)胞凋亡中的作用，筆者根據(jù)文獻(xiàn)[9]用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧模型的建立，并將體外合成的miR-1 mimic轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞，通過(guò)研究缺氧心肌細(xì)胞中miR-1與bcl-2的變化關(guān)系，探討microRNA-1在心肌細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果顯示，缺氧組細(xì)胞miR-1的表達(dá)水平升高、細(xì)胞凋亡明顯、bcl-2的mRNA和蛋白水平均降低，說(shuō)明miR-1不僅參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程，而且具有促凋亡的作用。單純轉(zhuǎn)染miR-1 mimic組也出現(xiàn)了缺氧組細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，說(shuō)明無(wú)論是什么原因引起的miR-1水平升高都會(huì)引起細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染的miR-1 mimic還可以進(jìn)一步加重缺氧心肌細(xì)胞的凋亡。本研究證實(shí)，miR-1在缺氧心肌細(xì)胞凋亡中具有重要的作用，bcl-2只是其作用機(jī)制之一，為全面了解miR-1的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（2013-08-26收稿2014-02-28修回）

（本文編輯魏杰）

Apoptotic Effects of MicroRNA-1 on Hypoxemic Cardiomyocytes

ZHENG Junyi，WANG Jixiang，XIAO Jianyong，CONG Hongliang Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300222,China
CONG Hongliang，E-mail:hongliangcong@163.com

ObjectiveTo investigate the apoptotic effect of microRNA-1(miR-1)on hypoxemic cardiomyocytes.MethodsThe cultured H9C2 cells were divided into 5 groups:normal control group,negative control group,H2O2group, miR-1 group and H2O2+miR-1 group.After verified the success of transfection by real time PCR,MTT and flow cytometry methods were used to test the cell vitality and apoptotic rate,while the mRNA and protein expression level of Bcl-2 were detected by real time PCR and Western blot methods.ResultsCompared with normal control group,there were no significant differences in all indexes in negative control group.The application of H2O2and miR-1 respectively or together significantly increased the miR-1 level and apoptotic rate,and reduced the cell vitality and Bcl-2 expression level.ConclusionmicroRNA-1 can induce cardiomyocyte apoptosis by downregulating anti-apoptosis factor Bcl-2.

microRNAs;anoxia;myocytes,cardiac;apoptosis;miR-1

R542.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.005

天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科（郵編300222）△

E-mail:hongliangcong@163.com