朱艷芳，馬應波，劉東華，張愛民,2，薛建平,2，盛 瑋,2

（1.淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000；2.資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽 淮北 235000；3.昆山東海農業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 昆山 215301）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus（L.）Moench）屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物，別名補腎草、秋葵和羊角豆等.相關研究表明，可食用的嫩果營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質、多糖、黃酮、不飽和脂肪酸、維生素等多種化合物，是一種營養(yǎng)型保健蔬菜［1-3］，美國人稱其為“植物偉哥”，日本人稱其為“綠色人參”，經常食用可增強人體體質，所以被許多國家定為運動員的首選蔬菜.許多研究還表明，黃秋葵的嫩果具有抗疲勞［4-5］、治療燒（燙）傷［6］等功能，黃秋葵多糖具有結合膽酸［7］及抗氧化［8］等作用.黃秋葵既是營養(yǎng)豐富的保健型蔬菜，又是療效顯著的常用中藥，其花、葉、芽、果均可食用.花、種子和根還可入藥，有滋陰補陽的功能，是一種名副其實的菜、藥、花兼用型植物［9］.因此，黃秋葵具有很高的開發(fā)價值.

黃秋葵原產于非洲東部地區(qū)，現(xiàn)廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地帶，上世紀90年代初黃秋葵被引入我國內陸.目前，我國大陸南北方各地均有黃秋葵的分布與栽培，種植較多的有北京、廣東、上海、山東、江蘇、浙江、海南、云南、安徽、福建等省市.目前對黃秋葵的果實研究比較多，但是，作為黃秋葵的副產物其花也含有多種營養(yǎng)成分，我們主要對黃秋葵花提取物的抗氧化活性進行初步研究，為黃秋葵花的開發(fā)利用提供依據.

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵花由江蘇省昆山東海農業(yè)發(fā)展有限公司提供.

六氰合鐵酸鉀（K3［Fe（CN）6］）、K2HPO4、KH2PO4、三（羥甲基）氨基甲烷、三氯乙酸（TCA）、FeCl3、95%乙醇、鄰二氮菲、鄰苯三酚、FeSO4、過氧化氫（H2O2）、HCl等均為國產分析純（購于上海國藥集團），DPPH·（二苯代苦味酰基自由基）（購于Sigma公司）.

UV-4802型紫外可見分光光度計（尤尼科上海儀器有限公司），ANO124電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司），RE52-98型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞容生化儀器廠）.

1.2 方法

1.2.1 黃秋葵花提取物制備

稱取一定量的干燥黃秋葵花，碾碎成粉末，過20目篩，按料液比為1：25加入65% 乙醇，在70 ℃水浴中浸提1.5 h，過濾得提取溶液，減壓濃縮后，真空冷凍干燥，即得黃秋葵花提取物粉未.

1.2.2 黃秋葵花提取物還原能力測定

將5 mL 不同濃度黃秋葵花提取液放于試管中，加入5 mL pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和5 mL 1% 的 K［3Fe（CN）6］，搖勻，50 ℃ 水浴保溫 20 min，快速冷卻，再加入 5 mL 的 10% TCA，混勻，6 000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清于試管中，再依次加入5 mL 蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3，充分混勻，靜置10 min，以蒸餾水為對照，分光光度計測定700 nm處的吸光度值A700nm，即可表示還原能力的強弱，A700nm越大還原能力越強［10-11］.

1.2.3 黃秋葵花提取物對DPPH·的清除能力測定

在5 mL DPPH· 溶液（6.5×10-5mol /L）中分別加入不同濃度的黃秋葵花提取物溶液1 mL，混勻后室溫靜置30 min，測定在517 nm 處的吸光度值，計算黃秋葵花提取物對DPPH· 的清除率［12］：

式中：AS為加入黃秋葵提取物在517 nm 處吸光度；AC為未加入樣品在517 nm 處吸光度.

1.2.4 黃秋葵花提取物對羥自由基（·OH）的清除能力測定

采用鄰二氮菲-Fe2+的方法［13］測定黃秋葵花提取物對·OH 的清除能力，步驟為：加入鄰二氮菲溶液、150 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液和黃秋葵花提取物溶液（損傷管及未損傷管不加黃秋葵花提取物，用蒸餾水補充體積），搖勻，加入FeSO4溶液快速搖勻，再加入H2O（2未損傷管不加），達到終濃度為：鄰二氮菲0.15%、FeSO40.75 mmol/L、H2O20.3%，總體積10 mL.37 ℃恒溫水浴1 h，測定各管在536 nm波長下的吸光度值A536nm，不同濃度黃秋葵花提取物對·OH的清除率按下式計算［14］.

其中A樣為加入黃秋葵花提取物和H2O2在536 nm的吸光度值，A損為加入H2O2在536 nm的吸光度值，A未損為不加入黃秋葵花提取液和H2O2在536 nm的吸光度值.

1.2.5 黃秋葵花提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力測定［15］

在不同濃度黃秋葵花提取物中加入50 mmol/L pH 8.4 的Tris-HCl 緩沖液，混勻后25 ℃水浴保溫20 min，加入25 ℃預熱的100 mmol /L鄰苯三酚溶液0.1 mL，快速混勻，啟動反應后每30 s測一次325 nm處的吸光度值A325nm，至4.5 min為止.將A325nm值與時間（min）進行回歸分析，其斜率為V0.不同濃度黃秋葵花提取物對O2·-的清除率按下式計算：

1.2.6 黃秋葵花提取物對由H2O2引起的小鼠紅細胞溶血的保護作用測定［16］

取成年昆明小鼠血用肝素鈉抗凝，低速離心取沉淀紅細胞，預冷生理鹽水洗滌數次，制備0.5%的紅細胞懸液.取1 mL 紅細胞懸液，加入0.5 mL 不同濃度的黃秋葵花提取物，以0.5 mL 0.05mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為陽性對照組，再加入0.5 mL的50 mmol/L H2O2開始反應.37 ℃下反應1 h后，生理鹽水稀釋5倍，4 000 r/min離心10 min，取上清液，分光光度計測415 nm處的吸光度值A415nm，按下式計算黃秋葵花提取物對由H2O2引起溶血的抑制率：

2 結果與分析

2.1 黃秋葵花提取物的還原能力測定

還原力是評價物質潛在抗氧化活性的重要指標，還原力大小與抗氧化力大小呈正相關.還原力強的物質是良好的電子和氫的供體，可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質，終止自由基的鏈式反應.同時，可與過氧化物的前體物質作用，阻止過氧化物的產生，進而起到抗氧化的作用［16］.在黃秋葵花提取物還原能力測定試驗中，提取物中黃酮類等還原性物質將六氰合鐵酸鉀中的Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+可生成在700 nm處有最大吸光度的Perl普魯士藍，分光光度計測定700 nm處的吸光度值來間接反映抗氧化劑還原能力的大小.由圖1可知,黃秋葵花提取物的還原能力隨著濃度的增大而增強，且呈明顯的量效關系.提取物濃度與還原力的線性方程為y=1.642 4x+0.030 1，相關系數R2為0.994 8，EC50（吸光度0.5 時樣品的質量濃度）為0.286 1 mg/ mL.

圖1 黃秋葵花提取物的還原能力Fig.1 Reducing activities of the extracts from okra flower

2.2 黃秋葵花提取物對DPPH·的清除效果

二苯代苦味?；杂苫―PPH·）是一種較穩(wěn)定的自由基，能與有供氫能力的化合物反應，其溶液呈深紫色，在517 nm波長處有最大吸收.當有抗氧化劑存在時，抗氧化劑與DPPH·反應使其吸光度值減小甚至消失，此變化與抗氧化劑的抗氧化能力及其數量呈定量關系.樣品的抗氧化活性可通過清除DPPH·的量來確定［17］.由圖2可知不同濃度的黃秋葵花提取物對DPPH· 均有一定的清除作用，且隨著濃度的增加清除率隨之增加.線性回歸分析表明，黃秋葵花提取物對DPPH·的清除率與提取物濃度符合一元二次方程模型，其方程為y=-105.76x2+145.56x+27.984，相關系數R2為0.997 8，半數清除濃度為0.173 mg/mL，說明黃秋葵花提取物具有較強的清除DPPH·的作用.

圖2 黃秋葵花提取物對DPPH· 的清除能力Fig.2 Scavenging activities of the extracts from okra flower on DPPH·

2.3 黃秋葵花提取物對·OH的清除效果

生物體內羥自由基是造成組織脂過氧化，蛋白質解聚、聚合，核酸斷裂，多糖解聚的重要活性氧.羥自由基清除率是反映物質抗氧化作用的重要指標［13］.橙紅色的鄰二氮菲-Fe2+被反應生成的·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+，在536 nm波長處的最大吸收峰消失，可利用鄰二氮菲-Fe2+的褪色程度來衡量·OH的清除量.由圖3可知，不同濃度的黃秋葵花提取物對反應中生成的·OH有一定的清除能力，且隨著黃秋葵花提取物濃度的升高，對·OH清除效果逐漸增強.多項回歸分析表明，黃秋葵花提取物對·OH的清除作用具有一定的量效關系，其關系方程為y=-299.68x2+360.48x-18.624，相關系數R2為0.984 4，半數清除濃度為0.237 mg/mL，說明黃秋葵花提取物是一種較強的羥基自由基（·OH）清除劑.

圖3 黃秋葵花提取物對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging activities of the extracts from okra flower on ·OH

2.4 黃秋葵花提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除效果

鄰苯三酚在弱堿性條件下發(fā)生自氧化反應，不斷生成超氧陰離子自由基（O2·-）及有色中間產物.抗氧化劑能將超氧陰離子自由基（O2·-）歧化分解為H2O2和O2，從而抑制鄰苯三酚的自氧化反應.中間產物積累濃度與時間呈線性關系，因此測定特定波長下的吸光度值變化，可得到加抗氧化劑后鄰苯三酚的自氧化速率，進而間接求得提取物清除超氧陰離子自由基（O2·-）的能力［17］.由圖4可知，不同濃度的黃秋葵花提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）有一定的清除作用，隨著濃度的增加清除率隨之增加.線性回歸分析表明，黃秋葵花提取物對O2·-的清除效果與提取物濃度關系方程為y=-30.566x2+97.545x-2.141，相關系數R2為0.999，半數清除濃度為0.679 mg/mL

圖4 黃秋葵花提取物對O2·-的清除作用Fig.4 Scavenging activities of the extracts from okra flower on O2·-

2.5 黃秋葵花提取物對溶血反應的抑制能力測定

由圖5可知，黃秋葵花提取物能有效地抑制紅細胞膜的破裂，保護紅細胞膜結構的完整性，并顯示出一定的量效關系.線性回歸分析表明，黃秋葵花提取物對紅細胞保護效果與提取物濃度之間關系符合一元二次方程模型，其方程為y=-63.996x2+125.35x+2.610 9，相關系數R2為0.987 9，對H2O2引起的紅細胞溶血半數抑制濃度為0.511 7 mg/mL.

圖5 黃秋葵花提取物對溶血的抑制能力Fig.5 Inhibition of hemolytic reaction of the extracts from okra flower

3 結論

本試驗結果表明，黃秋葵花提取物對清除羥自由基（·OH）、清除超氧陰離子自由基（O2·-）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）等活性氧具有較強的清除作用，并呈明顯的量效關系.在測定的質量濃度范圍內，黃秋葵花提取物對羥自由基（·OH）的清除能力大于對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力.羥自由基是造成組織細胞損傷的主要活性氧之一，能引起膜過氧化，蛋白質交聯(lián)變性，核酸損傷等，許多疾病如腫瘤、炎癥、癌癥、衰老、動脈硬化等的引發(fā)大多數和羥自由基（·OH）有關［18］.黃秋葵花提取物對羥自由基有很強的清除作用，是一種很有前景的待開發(fā)的抗氧化活性物質.本文只研究討論其體外抗氧化的部分試驗，至于黃秋葵花提取物在生物體內的抗氧化活性如何，我們將繼續(xù)深入研究.總之，對黃秋葵花提取物的生物抗氧化活性進行深入研究，論證黃秋葵花在功能性茶及功能性食品上具有很好的應用前景，從而提高黃秋葵種植的經濟效益.

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