董存智，吳雯輝

（淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

維生素K3（VK3）具有萘醌結(jié)構(gòu)，其主要生理作用是促進(jìn)血漿凝血因子的合成并參與人體的鈣代謝，可用于治療維生素K缺乏所引起的出血性疾病，屬于促凝血藥［1］.測定VK3的方法有光度法［2-3］、電化學(xué)法［4-5］、熒光法［6-7］、色譜法［8］等.由于VK3的不飽和酮結(jié)構(gòu)共軛體系較小，不能產(chǎn)生熒光，因此，測定VK3的熒光光度法主要是基于將VK3還原成具有熒光的醌萘酚化合物，通過測定醌萘酚化合物的熒光強度，求得VK3的含量，還原程度有可能對測量準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響.三聚氰胺俗稱蛋白精，是三嗪類含氮雜環(huán)化合物，其分子中含有共軛雙鍵（π鍵）結(jié)構(gòu).在堿性介質(zhì)中，當(dāng)受到紫外光照射后，其環(huán)外氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上，由于n電子的電子云幾乎與環(huán)上π軌道平行，共享了共軛π電子結(jié)構(gòu)，擴(kuò)大了其共軛雙鍵體系，故可發(fā)出較強的熒光［9］.基于其與Ag（I）發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成不發(fā)熒光的絡(luò)合物，已用于定影廢液中Ag（I）的測定［10］.實驗發(fā)現(xiàn)，在B-R緩沖溶液中，VK3與三聚氰胺作用，使三聚氰胺的熒光發(fā)生猝滅.由此，建立了熒光猝滅法測定VK3的新方法.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FP-6500熒光分光光度計（日本分光株式會社）.三聚氰胺溶液：2.0 g/L.VK3乙醇溶液：0.10 g/L（20%乙醇）.伯瑞坦-羅比森緩沖溶液（B-R）：pH 7.0.本實驗用水均為超純水，試劑均為分析純.

1.2 測定方法

在2只10 mL比色管中分別加入2.0 g/L的三聚氰胺溶液2.0 mL；pH 7.0的B-R緩沖溶液0.5 mL；其中一支加入適量0.10 g/L VK3溶液或待測液，另一支為試劑空白；用水定容至10 mL；混勻后靜置20 min.在λex/λem=256 nm/366 nm 處測量熒光強度，其中含VK3者的熒光強度為F，試劑空白的熒光強度為F0，計算ΔF=F0-F.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

三聚氰胺熒光光譜如圖1所示.由圖1可知，在pH 7.0的B-R緩沖溶液中，當(dāng)激發(fā)波長為256 nm時，三聚氰胺的發(fā)射峰位于366 nm處.三聚氰胺的熒光強度隨著VK3濃度的增加而減弱，其減弱程度與VK3的濃度呈線性關(guān)系.實驗選擇的激發(fā)波長為256 nm，發(fā)射波長為366 nm.

圖1 熒光光譜Fig 1 Fluorescence spectrum 1～3：Melamine +VK3 （0、4、8 mg/L）

圖2 pH的影響Fig 2 Effect of pH

2.2 酸度的影響

按照實驗方法，考察了Tris-HCl，硼酸-硼砂，B-R，巴比妥鈉-HCl 等緩沖溶液的影響.試驗結(jié)果表明，在B-R緩沖溶液中體系的熒光猝滅效果最好.改變B-R緩沖溶液的pH值，實驗結(jié)果如圖2所示，實驗發(fā)現(xiàn)pH在4.1～11.5之間時體系的測量結(jié)果變化不明顯，ΔF在7.0時有最大值.改變pH 7.0的B-R緩沖溶液用量，試驗發(fā)現(xiàn)加入量為0.5 mL時體系的ΔF有最大值，因此，實驗選擇pH 7.0的B-R緩沖溶液的加入量為0.5 mL.

2.3 反應(yīng)時間的影響

按實驗方法，改變反應(yīng)時間測量熒光強度與反應(yīng)時間的關(guān)系，實驗發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)20 min后體系的熒光強度趨于穩(wěn)定，體系的ΔF值在20-150 min內(nèi)保持穩(wěn)定，因此，反應(yīng)時間選擇為20 min.

圖3 反應(yīng)時間的影響Fig 3 Effect of reacting time

圖4 工作曲線Fig.4 Working curve

2.4 三聚氰胺用量的影響

按實驗方法，改變2.0 g/L的三聚氰胺溶液的加入量，實驗結(jié)果表明，隨著三聚氰胺用量的增大，體系的ΔF值增加，但用量過大時，三聚氰胺本身發(fā)生自體淬滅作用，綜合考慮靈敏度和線性范圍，實驗選擇三聚氰胺溶液的加入量為2.0 mL.

2.5 干擾試驗

在實驗條件下，試驗了不同物質(zhì)對VK3測定的影響，當(dāng)VK3濃度為6 mg/L，實驗相對誤差在±5%以內(nèi)時，各種物質(zhì)的允許共存倍數(shù)分別為：β-環(huán)糊精600倍；NH4+500倍；K+400倍；葡萄糖、Zn2+、SO42-、Mg2+、肝素鈉、VC50倍；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、尿素30倍；甘氨酸 20倍；輔酶15倍.

2.6 工作曲線

按實驗方法，改變VK3的加入量測量熒光強度.實驗結(jié)果用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到回歸方程為：

相關(guān)系數(shù)為0.998，方法的線性范圍為0.10～10.00 mg/L，根據(jù)12次空白實驗的3σ值求得方法的檢出限為0.085 mg/L.

2.7 樣品分析

取不同廠家生產(chǎn)的維生素K3粉（飼料添加劑）0.10 g（標(biāo)示量為每克含有5%的VK3），于研缽中研細(xì)混勻后置于小燒杯中，加0.10 mol/L NaOH 數(shù)滴及少量水使之溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用水定容.實驗時移取0.40 mL試液，按照實驗方法對樣品中VK3進(jìn)行測定，并做加標(biāo)回收試驗，實驗結(jié)果見表1.由實驗結(jié)果求得所測的維生素K3粉中VK3的含量為5.04%-5.33%.

表1 樣品分析結(jié)果（n=5）Tab.1 Analytical results of samples

2.8 猝滅機(jī)理與熱力學(xué)參數(shù)

引起體系熒光猝滅的原因可能包括動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種.動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程，其過程遵循Stern-Volmer方程［11］：

式（1）中F、F0分別為猝滅劑（即VK3）存在和猝滅劑不存在時的熒光強度，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，［Q］為猝滅劑濃度，τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命.而靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時生成不發(fā)光的配合物，從而導(dǎo)致熒光強度降低的過程，此過程可用下式描述：

式（2）中，K是配合物的形成常數(shù).

2.8.1 溫度的影響

按實驗方法，分別恒定溫度為20 ℃、30 ℃、40 ℃，測定體系熒光強度隨猝滅劑濃度的變化情況，以F0/F對［Q］作圖（圖5），求出20 ℃、30 ℃、40 ℃下的K值分別為 1.49×104L·mol-1、1.25×104L·mol-1、1.10×104L·mol-1.按照一般熒光分子τ0為10-8s 計算的Kq數(shù)值為1012L·mol-1·s-1，遠(yuǎn)大于擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，且隨著溫度的升高K值降低.說明在實驗條件下，VK3對三聚氰胺的猝滅屬于靜態(tài)猝滅，此時VK3與三聚氰胺之間可能形成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物.

圖5 Stern-Volmer 曲線Fig 5 Stern-Volmer curve

2.8.2 熱力學(xué)參數(shù)

根據(jù)如下熱力學(xué)公式：

由20 ℃、30 ℃的K值，計算熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH、熵變ΔS和自由能變ΔG，結(jié)果列于表2.從表2可看出VK3與三聚氰胺結(jié)合過程的ΔH＜0，表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)，升高溫度將不利于其向生成VK3-三聚氰胺配合物的方向進(jìn)行，VK3與三聚氰胺的結(jié)合常數(shù)隨溫度升高而減小，配合物穩(wěn)定性下降；反應(yīng)的ΔG＜0，說明VK3與三聚氰胺結(jié)合過程是一個自發(fā)過程.

表2 VK3與三聚氰胺結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Thermodynamic parameters of melamine–VK3 binding procedure

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