季婉茹，程 可，葛 凱，邵從英

（淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

藥物小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合作用的研究是介于生命科學(xué)和化學(xué)之間的一種新型課題，也是化學(xué)、生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的問題［1-4］.胃蛋白酶（Pepsin）存在于哺乳動(dòng)物胃腸道中，是重要的消化性蛋白酶，在酸性環(huán)境中具有較高活性.在中性或堿性的溶液中，因發(fā)生解鏈而喪失活性，在醫(yī)療和醫(yī)藥方面研究較多.

苯唑西林鈉（Oxacillin Sodium 簡寫為OXCL）屬于內(nèi)酰胺類半合成青霉素類抗生素，它主要用于治療產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌的感染，亦可用于治療化膿性鏈球菌或者是肺炎球菌和耐青霉素葡萄球菌所形成的混合型感染.抗菌作用方式和青霉素相似，它對青霉素酶葡萄球菌顯示了良好的抗菌活性，其通過抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用.本實(shí)驗(yàn)探討苯唑西林鈉與胃蛋白酶的主要作用力類型和熱力學(xué)函數(shù)的變化，同時(shí)計(jì)算反應(yīng)結(jié)合常數(shù)k與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，利用紫外吸收光譜法來考察苯唑西林鈉對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FP-8300 型（日本島津）熒光分光光度計(jì)；TU-1901 型（北京普析）雙光束紫外可見分光光度計(jì)；pHS-3D 型（上海虹益）精密pH 計(jì)；HH-4 型（國華電器）數(shù)顯恒溫水浴鍋；苯唑西林鈉（2.08×10-4mol·L-1）（99.0%純度）：準(zhǔn)確稱取0.459 1 g苯唑西林鈉（分子量441.44）（蘇州二葉制藥有限公司）用去離子水溶解稀釋配制50 mL 的備用液，取1.00 mL 該溶液轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，定容搖勻；胃蛋白酶（2.08 ×10-4mol·L-1）：準(zhǔn)確稱取1.820 2 g胃蛋白酶（分子量35 000，南京海辰藥業(yè)有限公司）用去離子水溶解稀釋，定容于250 mL容量瓶中（溶液保存到冰箱中待用）；B-R緩沖溶液：在三酸混合液0.1 L（磷酸、乙酸、硼酸，均為0.04 mol·L-1）中，加入0.2 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)整pH至1.81，用酸度計(jì)測定；冰箱1-4 ℃保存；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL的一系列比色管中依次加入pH為1.81的B—R緩沖溶液1.00 mL，胃蛋白酶溶液1.00 mL，再依次加入不同體積的苯唑西林鈉溶液，以去離子水定容至10.00 mL，搖勻，靜置20 min，分別記錄在290-500 nm范圍內(nèi)不同溫度下（288 K、298 K和308 K）的熒光發(fā)射光譜（以276 nm為激發(fā)波長，激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫也為5 nm）.在298 K時(shí)，記錄Δλ=15 nm與Δλ=60 nm的同步熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 胃蛋白酶的熒光光譜

圖1 苯唑西林鈉與胃蛋白酶熒光淬滅光譜Fig 1 Fluorescence quenching of pepsin（2.08×10-4 mol·L-1）in the presence of OXCL

對胃蛋白酶預(yù)掃描，得到胃蛋白酶的熒光最大發(fā)射峰為340 nm，固定胃蛋白酶濃度，向其中不斷加大苯唑西林鈉的濃度，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶熒光強(qiáng)度不斷降低，最大熒光發(fā)射波長也有較明顯的藍(lán)移，說明苯唑西林鈉能淬滅胃蛋白酶的內(nèi)源熒光，苯唑西林鈉與胃蛋白酶之間發(fā)生相互作用.

2.2 熒光淬滅的機(jī)理

熒光淬滅的過程可以分為靜態(tài)淬滅過程與動(dòng)態(tài)淬滅過程［5］.動(dòng)態(tài)淬滅過程是淬滅劑對熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子發(fā)生了相互作用，而靜態(tài)淬滅過程則是淬滅劑對熒光物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生作用，淬滅的數(shù)據(jù)可以通過Stern-Volmer方程［6］進(jìn)行分析：

式中F0和F分別為加入淬滅劑前后混合溶液的熒光強(qiáng)度，［Q］為淬滅劑的濃度，τ0為生物大分子平均熒光壽命（熒光淬滅劑不存在），一般生物大分子熒光壽命值大約為10-8s［7］，Kq為雙分子碰撞淬滅常數(shù)，Ksv為Stern-Volmer淬滅常數(shù).

一個(gè)熒光淬滅過程是動(dòng)態(tài)淬滅過程還是靜態(tài)淬滅過程可以通過在不同溫度下，淬滅常數(shù)Ksv的變化情況加以判斷.若是動(dòng)態(tài)淬滅過程，隨著溫度的不斷增加，Ksv的值也會不斷遞增，若是靜態(tài)淬滅過程，隨著溫度的不斷升高，而復(fù)合物的穩(wěn)定性會不斷降低，且對應(yīng)的淬滅常數(shù)也會隨之而降低［8-9］.

苯唑西林鈉對胃蛋白酶的熒光淬滅的機(jī)理，分別測定在pH1.81溫度分別為288 K，298 K，308 K時(shí)苯唑西林鈉對胃蛋白酶的熒光淬滅光譜.根據(jù)Stern-Volmer 方程，以F0/F對［Q］作圖，見圖2.

圖2 不同溫度下苯唑西林鈉對胃蛋白酶淬滅的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer plots for the binding of oxacillin sodium to pepsin at different temperatures

由圖2所得的淬滅常數(shù)及相關(guān)系數(shù)見表1.

表1 288 K，298 K和308 K時(shí)，OXCL和pepsin體系的淬滅常數(shù)和相關(guān)系數(shù)Table 1 Quenching constants and the correlation coefficients for the system of oxacillin sodium-pepsin at 288 K，298 K，308 K

表1表明：隨著溫度的升高，Stern-Volmer的斜率不斷增大，說明隨著溫度升高，OXCL 對pepsin的淬滅程度增大，該淬滅過程是動(dòng)態(tài)淬滅過程.

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

對于動(dòng)態(tài)淬滅而言，可以用下面方程來計(jì)算結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n［10］.

該式中，F(xiàn)0和F分別為加入淬滅劑前后混合溶液的熒光強(qiáng)度，［Q］為淬滅劑濃度，K為胃蛋白酶與苯唑西林鈉的結(jié)合常數(shù)，n是其結(jié)合位點(diǎn)數(shù).以lg［（F0-F）/F］對lg［Q］作圖見圖3.

圖3 不同溫度下苯唑西林鈉對胃蛋白酶體系的 log［（F0－F）/F］對 log［Q］的關(guān)系曲線Fig 3 plots for the system of oxacillin sodium-pepsin at different temperatures

胃蛋白酶與苯唑西林鈉的結(jié)合常數(shù)K以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可以通過圖3中直線的截距和斜率得到，見表2.

表2 不同溫度下苯唑西林鈉對胃蛋白酶的表觀結(jié)合常數(shù)K以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 Quenching constants and number of binding site for pepsin-oxacillin sodium system at different temperatures

由表2知，胃蛋白酶與苯唑西林鈉的結(jié)合常數(shù)K的值隨著溫度的升高而增大，表明該淬滅過程是動(dòng)態(tài)淬滅過程，胃蛋白酶與苯唑西林鈉的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n的值可推斷出胃蛋白酶與苯唑西林鈉之間有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn).

2.4 熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算和作用力類型的確定

蛋白質(zhì)與藥物之間的作用力主要包括氫鍵、疏水作用力、范德華力和靜電相互作用.蛋白質(zhì)和藥物之間相互作用的主要類型可以通過它們反應(yīng)前后的熱力學(xué)焓變和熵變的相對大小值來加以判斷.而熱力學(xué)焓變和熵變的值可以根據(jù)以下熱力學(xué)公式求得［11-12］，

根據(jù)生物大分子以及小分子的結(jié)合力性質(zhì)和系統(tǒng)中熱力學(xué)參數(shù)的關(guān)系［13～15］，ΔH＜0 以及ΔS＜0，其主要作用類型為氫鍵和范德華力；ΔH＞0 與ΔS＞0，主要作用類型則為疏水作用力；ΔH＜0 而ΔS＞0，主要作用類型則為靜電引力.由表2可知，ΔH＞0 以及ΔS＞0，因此苯唑西林鈉對胃蛋白酶的作用力類型主要為疏水作用力，而ΔG＜0，苯唑西林鈉與胃蛋白酶的作用過程是自發(fā)進(jìn)行.

2.5 能量轉(zhuǎn)移、結(jié)合位置的計(jì)算

根據(jù)F?rster 偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移的理論，若發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，則需滿足供能體發(fā)射熒光和受能體的吸收光譜有足夠的重疊亦或供能體與受能體可以足夠接近而且最大的距離小于8 nm.苯唑西林鈉的紫外-可見吸收光譜圖與苯唑西林鈉對胃蛋白酶的物質(zhì)的量1：1時(shí)的熒光光譜見圖4，由此可得兩光譜之間有一定的重疊.

圖4 苯唑西林鈉的紫外-可見吸收光譜b與苯唑西林鈉對胃蛋白酶的物質(zhì)的量1：1時(shí)的熒光光譜a的重疊光譜Fig 4 The overlap of the oxacillin sodium’s UV absorption spectrum of b with the fluorescence emission spectrum of pepsin a when the amount of substance ratio is 1：1

能量轉(zhuǎn)移效率（E）、供體和受體間的距離R以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0可由以下公式計(jì)算［16-17］：

式中R0：臨界距離（50%的能量轉(zhuǎn)移效率）；K2為偶極空間取向因子；N為折射指數(shù)（介質(zhì)）；Φ為熒光兩字產(chǎn)率（給予體）；J為重疊積分（供體熒光發(fā)射光譜和受體吸收光譜），在實(shí)驗(yàn)條件下K2=2/3，N=1.336，Φ=0.118［18］.J的值可根據(jù)下式計(jì)算得出

式中，在波長λ時(shí)，F(xiàn)（λ）為熒光強(qiáng)度（熒光給體）；ε（λ）為摩爾吸光系數(shù)（受體）.胃蛋白酶的內(nèi)源熒光主要是由色氨酸殘基產(chǎn)生的，將圖4中的胃蛋白酶的熒光光譜圖和苯唑西林鈉的紫外吸收光譜圖的重疊部分（陰影部分）按式（7）可求得光譜的重疊積分J=6.12×10-18cm3·L·mol－1，R0=0.71 nm，E=0.662，R=0.64 nm.因此，苯唑西林鈉在胃蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)與胃蛋白酶分子中的色氨酸殘基的距離為0.64 nm，小于8 nm，說明胃蛋白酶與苯唑西林鈉作用過程中發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移.

2.6 OXCL與pepsin構(gòu)象的影響

苯唑西林鈉和胃蛋白酶相互作用時(shí)的同步熒光見圖5.同步熒光光譜圖a（Δλ=15 nm）顯示了胃蛋白酶中酪氨酸殘基的光譜特性（見圖5a），而同步熒光光譜圖b（Δλ=60 nm）只顯示了胃蛋白酶中色氨酸殘基的光譜特性［19］（見圖5b）.

圖5 苯唑西林鈉和胃蛋白酶的同步熒光光譜Fig.5 The synchronous fluorescence spectra of pepsin in the present of oxacillin sodium

由圖5的熒光數(shù)據(jù)可知，酪氨酸殘基的內(nèi)源熒光強(qiáng)度明顯小于色氨酸殘基，說明色氨酸殘基是引起胃蛋白酶內(nèi)源熒光的主要因素.酪氨酸殘基所引起的最大熒光發(fā)射波長隨著苯唑西林鈉濃度的增大而發(fā)生明顯的藍(lán)移，說明由于苯唑西林鈉的加入使得熒光性質(zhì)發(fā)生了改變，使熒光基團(tuán)的疏水性［20］增加，從而極性減弱，而色氨酸殘基所引起的最大熒光發(fā)射波長隨著溶液中苯唑西林鈉濃度的增加而發(fā)生較明顯的紅移，說明苯唑西林鈉的加入使得熒光基團(tuán)的疏水性減小，從而極性增大，更進(jìn)一步說明苯唑西林鈉和胃蛋白酶之間發(fā)生了相互作用，隨著苯唑西林鈉的不斷加入，二者之間相互結(jié)合，形成復(fù)合物，引起了胃蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致構(gòu)象的變化［21］.

3 結(jié)論

本文利用紫外吸收光譜、熒光光譜研究在生理?xiàng)l件下苯唑西林鈉對蛋白質(zhì)的相互作用.研究表明：苯唑西林鈉對胃蛋白酶的作用力主要是疏水作用力，二者的結(jié)合過程自發(fā)進(jìn)行，淬滅類型為動(dòng)態(tài)淬滅，苯唑西林鈉與胃蛋白酶的相互作用使胃蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生了變化.

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