王志強 張付全 陳新宇 董昆侖 王棟

認知功能損害與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究*

王志強 張付全 陳新宇 董昆侖 王棟

目的探討認知功能損害與載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法采集46例正常對照(對照組)、67例輕度認知功能損害患者(MCI組)和42例AD癡呆期患者(DAT組)的外周血提取DNA，采用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)技術(shù)(PCR－RFLP)測定上述3組人群中ApoE等位基因的分布頻率。結(jié)果3種等位基因在對照組、MCI組和DAT組中的總體分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0．018)。ε2和ε3等位基因頻率在3組間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P=0．373，P=0．302)，但DAT組ε4等位基因的頻率顯著高于對照組(P=0．011)和MCI組(P=0．019)，ε4等位基因的頻率在對照組和MCI組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0．742)。結(jié)論ApoE ε4等位基因可能在DAT發(fā)病中發(fā)揮一定作用，但其與MCI的發(fā)生可能不具有關(guān)聯(lián)性。

Alzheimer’s病輕度認知功能損害載脂蛋白E關(guān)聯(lián)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年癡呆的最常見原因，它是一種原因不明的、進行性的、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，其特征性病理改變?yōu)榇竽X皮層及腦區(qū)的纖維蛋白沉積，即細胞外間隙的β淀粉樣蛋白(β－amyloid，Aβ)和細胞內(nèi)多聚Tau蛋白的沉積，兩者在病理形態(tài)學上分別表現(xiàn)為老年斑(SP)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)。最近有研究者提出從正常老年發(fā)展成AD癡呆是連續(xù)的過程，可以人為地分為幾個期:正常增齡期、無癥狀AD期、主觀記憶減退期、輕度認知損害期、中重度認知損害期、AD癡呆期(Dementia with Alzheimer type，DAT)。無癥狀AD期，即無主觀癥狀，也無可靠的、客觀的認知改變，但有AD的特征性病理改變;在無癥狀AD期，部分患者未經(jīng)特殊治療，可能會自發(fā)逆轉(zhuǎn);在主觀記憶減退期和輕度認知損害期，經(jīng)合理有效治療，部分患者可能會逆轉(zhuǎn);在中重度認知損害期以后，即使積極治療，也無法使病情逆轉(zhuǎn)，但能延緩疾病的進程。

當前的AD治療觀念認為在疾病的早期階段著手治療才是最本質(zhì)的，此激發(fā)了人們對高危人群更精確界定的興趣，如對輕度認知功能損害(Mild Cognitive Impairment，MCI)的研究及其對于AD早期診斷與治療的意義［1］。MCI指有記憶和(或)其他認知障礙，但個體正常工作、生活未受影響，亦不能由已知神經(jīng)精神疾病解釋，是介于正常衰老和癡呆之間的一種認知功能損害狀態(tài)，是一個仍有爭議的診斷概念［2］。如果能在AD早期的無癥狀階段經(jīng)過合理治療，多數(shù)患者可以逆轉(zhuǎn)或停止進展。由此看來，MCI的研究為AD的早期診斷、指導治療和改變預后具有重要的意義。

有關(guān)AD的真正病因目前還不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)了很多相關(guān)因素，如年齡、教育、社會心理因素、吸煙和飲酒、雌激素及B族維生素等，同時也提出了許多假說，如基因假說、tau蛋白異常修飾說、膽堿能學說，還有鋁中毒學說、鈣代謝紊亂學說、自由基損傷學說及代謝紊亂學說等［3～5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種與AD有關(guān)的基因，可解釋約50%AD患者的病因。APP基因與早發(fā)性家族AD(FAD)有關(guān)、載脂蛋白E(ApoE)基因與遲發(fā)FAD及散發(fā)AD(SAD)有關(guān)、早老素－1(PS－1)基因與AD的發(fā)生有關(guān)、早老素－2(PS－2)基因與AD的發(fā)生有關(guān)［6］。目前研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E(ApoE)ε4則是公認的遲發(fā)型散發(fā)性DAT(LOAD)的風險因子，有近2/3的DAT患者至少有一個ε4等位基因，DAT的患病率會隨著人體中ε4基因數(shù)量的增加而上升。ApoE ε4(ApoE ε4)通過促進β類淀粉蛋白(Aβ)的沉積和tau蛋白的異常磷酸化，增加攜帶者患AD的危險性，使發(fā)病年齡提前，是AD的危險因素。同樣，有研究提示ApoE ε4也是MCI的危險因素，使攜帶者患MCI的風險增加二至三倍［7］。本研究擬同時比較DAT患者、MCI患者及健康對照3組受試的ApoE多態(tài)性，以探討不同程度認知功能損害與載脂蛋白E (ApoE)等位基因的相關(guān)性。

1 對象與方法

1．1 對象本研究以MCI患者為研究對象，同時設(shè)計正常對照和DAT患者兩個對照組，各組樣本來源和入組標準如下。MCI組:來自社區(qū)共67例，其中男19例，女48例;所有被試的年齡在50歲以上，平均年齡(60．1±5．8)歲，教育年限(7．8±2．6)年。入組標準符合Petersen MCI診斷標準。DAT組:收集本院門診、病區(qū)患者及社區(qū)患者共42例，其中男8例，女34例，所有被試的年齡在50歲以上，平均年齡(66．1±9．2)歲，教育年限(6．3±4．1)年。入組標準符合美國精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DSM－Ⅳ)AD癡呆期臨床診斷標準。正常對照組:共46例，男13例，女33例，所有被試的年齡在50歲以上，平均年齡(61．2±6．5)歲，教育年限(9．3±2．8)年。入組標準:(1)無主觀認知損害的癥狀;(2)總體認知功能正常(MMSE≥28分，CDR=0分);(3)日常生活能力和社會功能正常; (4)目前和過去無明顯精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他影響認知功能的軀體疾病。所有入組樣本年齡均在50歲以上，居住在無錫市區(qū)，將職業(yè)分類為腦力勞動者、體力勞動者、技術(shù)服務者和其他;記錄婚姻狀況及受教育年限等。每個入組對象都收集病史資料、進行詳細的體格檢查及神經(jīng)系統(tǒng)檢查，病史資料包括既往病史、目前軀體健康狀況和心理健康狀況。3組研究對象性別方面比較無顯著性差異(P＞0．05)。

1．2 ApoE基因多態(tài)性檢測(1)血樣本收集與處理:各組研究對象在早晨8點空腹(12 h)抽取靜脈血2 ml，使用依地酸(EDTA)抗凝，置于－80℃冰柜中儲存待用，樣本收齊后相同條件下抽取基因組DNA，溶于Tris溶液中并置于40℃冰箱中待用。(2)擴增ApoE基因片段:采用聚合酶鏈反應PCR技術(shù)擴增ApoE基因片段，使用的PCR擴增儀由德國eppendorf公司生產(chǎn)。將第112位點及158位點的堿基分別測出，具體分型方法［8，9］及依據(jù)ApoE 112位及ApoE 158位的堿基不同進行，ε2/ε2(112T/T，158T/T)、ε3/ε3 (112T/T，158C/C)、ε4/ε4(112C/C，158C/C)、ε2/ε3 (112T/T，158C/T)、ε2/ε4(112C/T，158C/T)、ε3/ε4 (112C/T，158C/C)。檢測步驟如下:112位點引物為:上游引物:AGGCCATGCTCGGCCAGA;下游引物: GGCCAGGGAGCCCACAGT(上海生工研究所合成)。反應體積5l內(nèi)含DNA模板0．1 μl、10X ExTaq buffer 0．5 μl，dNTP0．4 μl、dH2O 3．4 μl、ExTaq聚合酶0．1 μl，DMSO 0．3 μl，上游引物0．1 μl，下游引物0．1 μl上以等體積石蠟油覆蓋。反應條件:加Taq酶前95℃5 min預變性，以后95℃變性30 s，65℃復性30 s、72℃延伸30 s，共35循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃維持7 min，4℃保存。擴增片段長度230 bp。(3)內(nèi)切酶消化:取PCR擴增物5 μl加入10X M 1．5 μl，HaeII(10 U/μl) 0．05 μl，dH2O 8．5 μl共15 μl的體積，于37℃酶切過夜，加入1 μl 0．5 mol/L EDTA終止反應。(4)電泳分離酶切產(chǎn)物:酶切產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠，于0．5X TBE電解溶液中電泳，電壓60伏，時間2 h。分離酶切產(chǎn)物片段，溴化乙錠(EB)染色，紫外燈觀察并攝影。根據(jù)酶切片段長度確定堿基類型CC:106 bp、58 bp、37 bp、19 bp、14 bp;TT:142 bp、58 bp、19 bp、14 bp; CT:142 bp、106 bp、58 bp、37 bp、19 bp、14 bp。ApoE 158位點引物為:上游引物:CGCTGATGGA CGAGACCATGAAGGAG;下游引物:TACTGCACCAGG CGGCTGC。反應體積5 μl內(nèi)含DNA模板0．1 μl、10X ExTaq buffer 0．5 μl，dNTP 0．4 μl、dH2O 3．7 μl、ExTaq聚合酶0．1 μl，上游引物0．1 μl，下游引物0．1 μl上以等體積石蠟油覆蓋。反應條件:守先以95℃5 min預變性，以后95℃變性30 s，65℃復性30 s、72℃延伸30 s，共21循環(huán)，再于95℃30 s，68℃90 s進行20個循環(huán)，結(jié)束后68℃維持7 min，4℃保存。擴增片段長度209 bp。內(nèi)切酶消化:取PCR擴增物5 μl加入10X Buffer W 1．5 μl，Acc16I(4 U/μl)0．0 5μl，10X BSA 1．5 μl，dH2O 7 μl共15 μl的體積，于37℃酶切過夜，加入1 μl(0．5 mol/L)EDTA終止反應。電泳分離酶切產(chǎn)物:酶切產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠，于0．5X TBE的電解溶液中電泳，電壓60伏，時間2 h。分離酶切產(chǎn)物片段，溴化乙錠(EB)染色，紫外燈觀察并攝影。根據(jù)酶切片段長度確定堿基類型CC:170 bp、36 bp; TT:209 bp;CT:209 bp、170 bp、36 bp。

1．3 統(tǒng)計學方法使用R統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的卡方檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．13 組研究對象ApoE等位基因和基因型的頻數(shù)分布ApoE有3種亞型E2、E3、E4，分別由3種等位基因ε2、ε3、ε4編碼，其中ε3為主要等位基因，ε2和ε4為次要等位基因。3種等位基因在對照組、MCI組和DAT組中的總體分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0．018)。ε2、ε3等位基因在3組之間的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，ε4等位基因在3組之間的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0．005)。見表1。進一步比較3組之間ApoE ε4等位基因的差異，發(fā)現(xiàn)DAT組ε4等位基因的頻率顯著高于對照組(P=0．011)和MCI組(P=0．019)，但MCI組和對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0．742)。

表1 ApoE等位基因在3組研究對象中的頻率分布［頻數(shù)(%)］

3 討論

在西方國家DAT是最普通的癡呆形式，并且是65歲以上人群中殘疾的直接原因。ApoE是一個隱含在脂質(zhì)代謝和神經(jīng)生物學中的多功能蛋白，目前已將ApoE基因的多態(tài)性與各種醫(yī)學的癥狀相聯(lián)系起來。從動脈硬化到DAT，ApoE ε4等位基因的高頻率在DAT患者中發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)他們似乎對于疾病的進展有更高的危險性［10］。

本研究的主要目的是通過比較對照組、MCI組和DAT組ApoE ε4等位基因的分布頻率來探討ApoE基因多態(tài)性與認知功能損害的相關(guān)性。ApoE等位基因的檢測結(jié)果顯示DAT組ε4等位基因的分布頻率均高于MCI組和對照組。上述結(jié)果提示ε4等位基因可能是DAT的危險因子，與既往的一些研究報道相一致［11］。本研究中DAT組的ε4等位基因頻率與Jacquier M等報道的ε4等位基因的分布頻率20．8%相近［11］。Drzezga A等［12］在隨訪期內(nèi)發(fā)現(xiàn)ApoE ε4陽性的17名中有9名進展為臨床DAT，4名純和體中的3名進展為DAT，而13名ApoE ε4陰性中的10名依舊保持臨床穩(wěn)定狀態(tài)。

Mosconi L等［13］比較ε4攜帶者與未攜帶者rCMRglc時發(fā)現(xiàn)，ε4攜帶者在顳頂葉、額葉皮層和后側(cè)腹內(nèi)皮層代謝減退。在隨后進展為癡呆的患者中，發(fā)現(xiàn)女性ε4攜帶者較男性出現(xiàn)顯著的認知功能損害。Fleisher A等［14］的研究發(fā)現(xiàn)在MCI人群中，與未攜帶ApoE ε4等位基因的MCI個體相比，攜帶1個或2個ε4等位基因的女性海馬體積明顯降低，而男性只有攜帶2個ε4等位基因時才表現(xiàn)出海馬體積的明顯下降。ApoE ε4基因?qū)τ诳傮w的海馬病理學和記憶性能在女性中將呈現(xiàn)出比男性更大的毒性效應。Farlow MR等［15］研究發(fā)現(xiàn)攜帶ApoE ε4等位基因的個體顯示出類似早期阿爾茨海默病的表現(xiàn)，推斷ApoE ε4等位基因與記憶和執(zhí)行功能高度損害及海馬萎縮相關(guān)。

Fleisher A等［14］發(fā)現(xiàn)認知功能損害的基本趨勢是ε4等位基因攜帶者比無ε4等位基因者嚴重。詞語延遲回憶性能的惡化呈現(xiàn)出一個同樣的模式與ApoE ε4等位基因的劑量和性別相關(guān)，即在男性中對于海馬的影響是削弱的，但是在女性中依舊是明顯的。Lambert JC等［16］研究也發(fā)現(xiàn)ApoE基因ε4等位基因是DAT的主要遺傳危險因素，且在女性中比男性有更高的危險關(guān)聯(lián)。有些研究顯示ApoE的水平可能是調(diào)節(jié)DAT發(fā)病的危險因素，ApoE的表達受雌二醇的影響。ApoE ε4編碼和－219G/T啟動子基因的多態(tài)性受雌二醇影響，在與雌二醇結(jié)合的反應中改變轉(zhuǎn)錄子的活性。此依賴于誘導ApoE調(diào)節(jié)的雌二醇的等位基因可增加攜帶ε4等位基因女性患DAT的危險。

Sheffield VC等［17］研究發(fā)現(xiàn)攜帶ApoE ε2/ε3基因型的人群發(fā)病年齡較晚，臨床癥狀較輕，推測ε2等位基因具有選擇性保護作用。Blacker D等［18］研究發(fā)現(xiàn)攜帶至少一個ApoE ε2等位基因副本的正常個體隨著時間的推移進展為認知損害的可能比沒有攜帶ApoE ε2等位基因的個體要小的多。本研究未發(fā)現(xiàn)ε2等位基因與認知功能損害具有相關(guān)性，可能是由于本研究的樣本是量較少。

既往研究主要關(guān)注DAT患者與ApoE的相關(guān)性，本研究則同時包括了MCI患者的ApoE等位基因分布情況。我們的研究發(fā)現(xiàn)MCI組和對照組之間的ApoE基因多態(tài)性的分布相似，而與DAT組具有較大差異。該結(jié)果表明MCI在遺傳基礎(chǔ)上不同于DAT，提示MCI可能是有別于DAT的一種認知損害;或者MCI是一個更廣泛的類別，因此具有更大的異質(zhì)性，可能既包括了攜帶ε4等位基因、最終轉(zhuǎn)化為DAT的個體，也包括未攜帶ε4等位基因、最終未轉(zhuǎn)化為DAT的個體。

本研究顯示ApoE ε4等位基因頻率升高可能在DAT發(fā)病中發(fā)揮一定的作用，但不支持其與MCI的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性。

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《精神醫(yī)學雜志》編輯部

An association study on polymorphisms of Apolipoprotein Egene and mild cognitive impairment．

WANG Zhiqiang，ZHANG Fuquan，CHEN Xinyu，et al．Wuxi Mental Health Center Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi 214151，China

ObjectiveTo explore the association between the polymorphisms of Apolipoprotein E(ApoE)gene and cognitive impairment．MethodsDNA was isolated from peripheral blood of 46 healthy controls(control group)，67 subjects with mild cognitive impairment(MCI group)and 42 subjects with dementia with alzheimer type(DAT group)．Polymorphisms of ApoE were detected by using polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism(PCR－RFLP)．ResultsThere was significant difference in the overall distribution of ApoE alleles among the three groups(P=0．018)．There were no significant differences in the distribution of ε2 and ε3 alleles among the three groups(P=0．373，0．302 respectively)．However，the frequency of ApoE ε4 was significantly higher in DAT group than that in control group(P=0．011)and MCI group(P= 0．019)．There was no significant difference in the frequency of ApoE ε4 alleles between control group and MCI group(P= 0．742)．ConclusionApoE ε4 allele may play a role in the development of DAT，but it is unlikely to be associated with MCI．

Alzheimer’s diseaseMild cognitive impairment(MCI)Apolipoproteins EAssociation

R749．1

A

1009－7201(2014)－06－0413－04

10．3969/j．issn．1009－7201．2014．06．004

2014－07－07)

國家自然科學基金資助項目(編號:30670714);江蘇省自然科學基金項目(編號:BK2006028)

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