劉妍芳，張 謙，韓振魁，斯坎德爾，羅蘇明

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830001)

PKM2在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征之間的關系

劉妍芳，張 謙，韓振魁，斯坎德爾，羅蘇明

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830001)

目的 探討PKM2在人胃腺癌組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)之間的關系。方法 采用免疫組化SP法檢測67例胃腺癌組織、53例癌旁組織中PKM2蛋白的表達及其與臨床病例參數(shù)之間的關系。結果 PKM2蛋白在胃腺癌組織中的陽性表達(67.2%，45/67)明顯高于癌旁組織中PKM2蛋白的表達(28.3%，15/53)，PKM2蛋白在胃腺癌組織中的陽性表達與患者的性別、年齡、分化程度均無關(P＞0.05)，而與患者的淋巴結(χ2=12.103，P=0.001)是否轉移與腫瘤侵潤深度(χ2=4.030，P=0.045)密切相關。結論 PKM2蛋白在胃腺癌組織中的陽性表達明顯高于癌旁組織，且其陽性表達與患者淋巴結與否、腫瘤侵犯深度密切相關，有望成為胃腺癌診斷與治療的靶向標志物。

胃腺癌；PKM2；免疫組織化學

1.2 方法與試劑 所有120例標本均經過4%的多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋，常規(guī)制備4 μm厚度連續(xù)切片，并使用免疫組化SP法嚴格按照說明書進行檢測。二甲苯脫蠟，檸檬酸緩沖液進行抗原修復，10%正常羊血清室溫孵育，兔抗人單克隆抗體PKM2孵育4°過夜(抗體購自Cell Signaling Technology，抗體的使用濃度為1：200)，進而常溫二抗孵育，DAB顯色等步驟。使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。SP試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自中山金橋生物有限公司。

1.3 結果判定 采用半定量積分方法[7]，每張切片選擇5個高倍視野，計數(shù)不少于1 000個細胞，依據(jù)視野下陽性細胞數(shù)進行評分：陽性細胞數(shù)為0%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，＞75%為4分。依據(jù)染色強度評分：細胞未著色或呈淡黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分。采用將顯色深淺與顯色范圍評分相乘的方法進行綜合評分，而為便于統(tǒng)計分析，統(tǒng)一將0～3分為陰性，4～8分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對結果進行處理，計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PKM2在胃腺癌組織中的表達情況 PKM2在67例胃腺癌組織中有45例為陽性表達，陽性表達率為67.2%(45/67，圖1)，且主要定位在胞質中，而53例癌旁組織中僅有15例陽性表達，其陽性表達率為28.3%(15/53)，明顯低于PKM2在胃腺癌組織中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 PKM2在胃腺癌組織及癌旁組織中的表達

2.2 PKM2在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)間的關系 PKM2蛋白在胃癌組織中的表達與性別、年齡、分化程度均無關(P＞0.05)，而有淋巴結轉移組PKM2蛋白的表達率明顯高于無淋巴結轉移組(χ2=12.103，P=0.001)，腫瘤侵潤深度T3+T4組PKM2蛋白表達明顯高于T1+T2組中PKM2的表達率(χ2=4.030，P=0.045)，差異均具有統(tǒng)計學意義，見表2。

臨床病理因素 分類PKM2χ2值P值年齡(歲)≥60＜60 0.3690.544性別陰性13 9 150.2280.633淋巴結轉移與否7 7 1 12.1030.001分化程度男女是否G 1 0.1950.097腫瘤侵潤深度5 6 9 7 1 4.0300.045大小(cm) G2 G3 T1+T2 T3+T4＞5≤5陽性30 15 28 17 35 10 13 20 12 15 30 26 19 3 9 1 2 100.0630.802

圖1 PKM2在人胃腺癌組織與癌旁組織中的表達

3 討論

丙酮酸激酶是糖酵解途徑的一個關鍵酶，其具有四種同工酶(L-PK、R-PK、M1-PK、M2-PK)，而這四種同工酶通常以酶的活性四聚體形式存在，其分布亦有一定的組織特異性。M2-PK主要分布于腸、肺以及增殖或未分化的組織中，新近的研究逐漸發(fā)現(xiàn)在人類多種惡性腫瘤中亦有PKM2的異常表達，在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要的作用。二十世紀50年代，諾貝爾獎得主奧托·瓦伯格提出所謂的“Warburg效應，”即由于腫瘤細胞的生長速度過快，明顯高于正常組織，使得腫瘤細胞經常處于一種缺氧狀態(tài)，為適應這種狀態(tài)，癌細胞關閉線粒體的有氧氧化，從而基本依賴糖酵解供能[8]。隨著對惡性腫瘤代謝機制的進一步研究，發(fā)現(xiàn)存在于惡性腫瘤細胞內的PKM2可促進腫瘤細胞“Warburg效應”的發(fā)生，并對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起著至關重要的作用。PKM2的存在形式以活躍的四聚體和活性低的二聚體為主，而兩者之間的轉化速度主要由糖酵解磷酸化代謝果糖-1，6-二磷酸鹽(Fructose-1，6-Diphosphate，F(xiàn)DP)控制，生理情況下，F(xiàn)DP水平和PKM2活性極低，而在腫瘤細胞中，F(xiàn)DP水平上調并PKM2的活性增加，使得低活性的二聚體向高活性的四聚體轉變的速度加快，從而促進惡性腫瘤細胞中糖酵解的速度[9-10]。

隨著研究的深入，PKM2在人類多種惡性腫瘤細胞中異常表達，包括目前發(fā)現(xiàn)的在大腸癌患者的糞便樣品中，肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、卵巢癌血漿中以及胸部惡性腫瘤患者的胸腔積液中都可檢測到PKM2蛋白的存在，肝癌、大腸癌腫瘤組織中PKM2的表達亦增高，且其含量與腫瘤的分期密切相關[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)PKM2在人胃腺癌組織中的表達率(67.2%，45/67)明顯高于其癌旁組織(28.3%，15/53)，且差異具有統(tǒng)計學意義，提示PKM2蛋白的表達可能與胃腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關，與之前的研究結果[12]基本一致。Christofk等[13]的研究結果顯示PKM2的高表達可以促進腫瘤細胞的糖酵解的異常激活，通過使用shRNA技術敲除人肺癌細胞株H1299 PKM2基因后，致瘤性明顯降低。在PKM2蛋白表達與腫瘤臨床病理參數(shù)之間的關系分析中顯示高表達的PKM2蛋白與腫瘤患者的性別、年齡以及腫瘤的組織學分化程度均無關，而與淋巴結轉移與否以及腫瘤侵犯深度有關，提示PKM2蛋白的表達可能參與到胃腺癌的侵襲與轉移過程中。譚麗等[14]的研究提示使用siRNA敲除BGC-823細胞PKM2后，與對照組相比BGC-823細胞所表現(xiàn)的腫瘤遷移作用明顯下降。這可能是由于PKM2蛋白被下調后，糖代謝發(fā)生異常，使得ATP能量供應嚴重缺乏，最終影響細胞的增殖與遷移等生物學行為。

綜上所述，人胃腺癌組織中PKM2的表達明顯高于其癌旁組織，且與患者淋巴結轉移與否，腫瘤侵犯深度密切相關，提示PKM2在胃腺癌的進展與遷移中可能發(fā)揮著重要的作用，但其在胃腺癌組織中的具體機制，還有待我們進一步探討，以期為胃腺癌的早期診斷與靶向治療提供一個新的方向。

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Expression and clinical significance of PKM2 in human gastric adenocarcinoma.

LIU Yan-fang,ZHANG Qian, HAN Zhen-kui,Sikandeer,LUO Su-ming.
Department of Gastrointestinal Surgery，the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous,Urumqi 830001,Xinjiang,CHINA

Objective To investigate the immunohistochemical expression and diagnostic significance of PKM2 in human gastric adenocarcinoma.MethodsImmunohistochemical study was carried out to examine the expression of PKM2 and its association with clinicopathologic features in human gastric adenocarcinoma.ResultsThe positive rate for PKM2 expression in gastric adenocarcinoma tissues(67.2%,45/67)was significantly higher than that in non-tumor tissues(28.3%,15/53);the positive expression of PKM2 was not correlated with the patient's gender,age and histologic differentiation(P＞0.05)except lymph node metastasis(χ2=12.103,P=0.001)and tumor invasion(χ2= 4.030,P=0.045).ConclusionPKM2 prefers stainning for gastric adenocarcinoma to for non-tumor tissues,and the positive expression was correlated with lymph node metastasis and tumor invasion.

Gastric adenocarcinoma;PKM2;Immunohistochemisty

R735.2

A

1003—6350（2014）02—0161—03

1 材料與方法

韓振魁。E-mail：qwertyu1213123@126.com

2013-07-22)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.02.0062

胃癌（Gastric cancer，GC）是全球第四常見惡性腫瘤，在所有腫瘤致死率中排名名第二[1]，就我國而言，其發(fā)病率和死亡率均居各類腫瘤首位。由于其發(fā)病的隱匿性，使得胃癌常常在確診時已處于進展期(Ⅲ期或Ⅳ期)，預后較差[2]。目前為止，針對胃癌有效的分子靶向治療仍然較少[3]。因此，尋找胃癌新的分子標志物，提高胃癌早期確診率，以及尋找胃癌治療的新的靶點顯得尤為重要。M2型丙酮酸激酶(M2 isoform of pyruvate kinase，PKM2)為細胞糖酵解過程中的關鍵酶，其在三磷酸核苷的合成過程中起決定性作用[4]。近年發(fā)現(xiàn)其在包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞或組織中呈過表達，在腫瘤的代謝過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[5-6]，但PKM2在胃腺癌組織中的表達尚未見報道。本文采用免疫組化SP法檢測67例胃腺癌組織，53例癌旁組織中PKM2的表達情況，并初步探討其與臨床病理參數(shù)之間的關系，為下一步實驗研究奠定基礎。

1.1 一般資料 收集我院2008年1月至2013年1月期間外科手術切除的120例石蠟標本，其中包括胃腺癌組織67例，均經HE染色確診為胃腺癌；以及取同一標本距癌組織邊緣3 cm以上的胃組織，均經HE染色證實無腫瘤細胞浸潤，無明顯細胞增生等病變的癌旁組織53例。所有的病例術前均無化療、放療及免疫治療史。67例胃腺癌組織中男性標本43例，女性24例，年齡47～73歲，中位年齡63歲；高分化19例，中分化29例，低分化19例；伴淋巴結轉移42例，不伴淋巴結轉移25例。腫瘤浸潤深度：按照國際TNM分期標準，局限于黏膜或黏膜下層的早期胃癌定為T1，侵及胃壁肌層，但大小不超過一個分區(qū)的1/2的為T2，腫瘤侵及胃壁漿膜層，或雖未侵及漿膜層，但病變已大于一個分區(qū)的1/2，但未超出一個分區(qū)定為T3，腫瘤占一個分區(qū)以上或已累及周圍臟器定為T4，其中T1+ T2組28例，T3+T4組39例。