王立，張曉薇

(1.廣東省江門(mén)市新會(huì)區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所，廣東江門(mén) 529100; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070)

矮牽牛轉(zhuǎn)SAG12－IPT基因的研究

王立1，張曉薇2

(1.廣東省江門(mén)市新會(huì)區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所，廣東江門(mén) 529100; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070)

通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，以矮牽牛(Petunia hybrida Vilm)為例，將延長(zhǎng)植物衰老的有效基因SAG12－IPT轉(zhuǎn)入矮牽牛中，經(jīng)抗生素篩選，得到了再生的轉(zhuǎn)化植株，以克服其花期短尤其切花時(shí)間短的缺點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因花卉的研究和推廣提供理論支持，利于切花花卉在家居裝飾中的運(yùn)用推廣。

矮牽牛;葉片衰老;SAG12;組織培養(yǎng)

矮牽牛(Petunia hybrida Vilm.)原產(chǎn)南美，茄科矮牽牛屬。花大色艷，花色豐富，為長(zhǎng)勢(shì)旺盛的裝飾性花卉，而且還能做到周年繁殖上市，可廣泛用于花壇布置、花槽配置、景點(diǎn)擺設(shè)、窗臺(tái)點(diǎn)綴、家庭裝飾。該花抗旱性好、花期較長(zhǎng)，受到人們的青睞，需求量與日俱增。

花卉花期的長(zhǎng)短與許多因素相關(guān)，如溫度、營(yíng)養(yǎng)等外界環(huán)境因素。通過(guò)改變環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等方法可達(dá)到延長(zhǎng)花期的目的，但這些外在的手段費(fèi)時(shí)費(fèi)力。如果能通過(guò)基因工程手段改變其遺傳基礎(chǔ)，則可選育具有遺傳穩(wěn)定性的花期延長(zhǎng)的新材料。本實(shí)驗(yàn)將含有SAG12－IPT基因載體的質(zhì)粒(美國(guó)威斯康星大學(xué)Amasino教授提供)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EH105和ABI菌株中，通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化矮牽牛幼葉或莖尖，獲得轉(zhuǎn)化植株。本研究以矮牽牛的幼葉或葉柄為轉(zhuǎn)化起始材料，采用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)化植株采用PCR、Southern、RT－PCR及Northern等方法進(jìn)行分子鑒定。研究中所涉及的技術(shù)為植物組織培養(yǎng)和分子生物學(xué)的常用技術(shù)。

1 ⅡSAG12-IPT基因

1.1 1SAG12啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)IPT植株中的應(yīng)用

1994年Lohman等［1］從擬南芥中分離得到一組衰老相關(guān)基因(SAGs)。研究表明:SAG12具有高度的衰老特異表達(dá)特性，可驅(qū)動(dòng)IPT基因在植物衰老葉片中表達(dá)，有效調(diào)控內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量，在不影響植株正常發(fā)育的前提下，達(dá)到延緩葉片衰老的目的。

1995年Gan等［2］把SAG12特異啟動(dòng)子與IPT構(gòu)建形成PSAG12－ipt嵌合基因，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這種新型轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，葉片衰老明顯延遲，花數(shù)和生物量也有所增加，但形態(tài)方面無(wú)明顯差別，根系發(fā)育完全，頂端優(yōu)勢(shì)得到保持，在生理方面也表現(xiàn)出光合作用的延長(zhǎng)。同時(shí)，還對(duì)PSAG12－ipt和PSAG12－gus轉(zhuǎn)化株的GUS活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:前者的GUS活性的提高明顯比后者緩慢，說(shuō)明PSAG12－ipt自調(diào)控系統(tǒng)確實(shí)起到了自動(dòng)調(diào)節(jié)的作用。PSAG12－ipt自調(diào)控系統(tǒng)具有低水平表達(dá)、自動(dòng)調(diào)節(jié)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，不需耗費(fèi)較大的人力物力就可能延緩作物衰老，提高產(chǎn)量。這些都為轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)業(yè)推廣奠定了基礎(chǔ)。

1.2 PSAG12-ipt轉(zhuǎn)化植株和衰老調(diào)控

編碼細(xì)胞分裂素生物合成限速步驟合成酶—異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl－transferases)的基因首先在根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中得到鑒定，被稱為IPT基因。隨著擬南芥基因組測(cè)序工作的完成，對(duì)IPT基因又有了新的了解。研究表明:擬南芥的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是被一個(gè)小的多基因家族編碼，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和tRNA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶相似［3］。進(jìn)行基因產(chǎn)物的生化分析還揭示了ADP和ATP是反應(yīng)的優(yōu)先底物。在對(duì)植物葉片衰老研究過(guò)程中，根據(jù)差異篩選和減扣雜交等檢測(cè)手段，發(fā)現(xiàn)衰老葉片的RNA總量下降，特別是rRNA水平劇烈下降。相反，某些基因則在衰老開(kāi)始后表達(dá)量逐漸升高，這類(lèi)基因被稱為SAG基因［4］。

目前已從擬南芥中克隆出SAG12。該基因的一部分功能已被證實(shí)與衰老細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)的降解轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，如編碼核酸酶、蛋白酶、酯酶、谷氨酰胺合成酶等的基因［4］。用帶有源于擬南芥的衰老相關(guān)基因SAG12啟動(dòng)子和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II)選擇基因的雙元質(zhì)粒作為載體。將克隆自土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的IPT基因?qū)腚p元質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，利用構(gòu)建的含IPT基因的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等途徑轉(zhuǎn)化植株，按照規(guī)定的程序獲得轉(zhuǎn)基因株系。獲得的轉(zhuǎn)基因植株還要通過(guò)PCR、Southern雜交等對(duì)所轉(zhuǎn)IPT基因的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)GUS活性和細(xì)胞分裂素含量的分析，證明抑制衰老的自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植株中得到表達(dá)［4］。當(dāng)葉片開(kāi)始衰老時(shí)，SAG12基因啟動(dòng)子(PSAG12)被激活，表達(dá)IPT基因合成細(xì)胞分裂素。通過(guò)細(xì)胞分裂素抑制核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、蛋白酶等的活性，延緩核酸、蛋白質(zhì)、葉綠體等的降解。同時(shí)細(xì)胞分裂素可促使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向應(yīng)用部位移動(dòng)。

1.3 PSAG12-ipt對(duì)植株的生理影響

PSAG12－ipt轉(zhuǎn)基因植株除了延緩下部葉片衰老外，其他形態(tài)學(xué)和野生型對(duì)照基本相同，如株高、葉型、側(cè)芽萌發(fā)等［5］。但轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，這可能是由于植株在早期生長(zhǎng)時(shí)所轉(zhuǎn)基因被激活引起的。研究還發(fā)現(xiàn)，PSAG12－ipt轉(zhuǎn)基因植株莖干變粗，莖干內(nèi)部的水含量也相應(yīng)增加。已知細(xì)胞分裂素可以增加內(nèi)部還原性糖的含量。因此，這些還原性糖的積累可能會(huì)導(dǎo)致滲透壓的增加，促使植物吸水和細(xì)胞膨脹，最終使得莖干變粗和莖干內(nèi)水量增加。轉(zhuǎn)PSAG12－ipt基因還可延緩由水澇脅迫引起的衰老。當(dāng)水澇脅迫消除后，轉(zhuǎn)基因株系糖、葉綠素、細(xì)胞分裂素和脫落酸的恢復(fù)都比野生型迅速，轉(zhuǎn)基因植株根部細(xì)胞分裂素積累更快［6］。

2 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)活力較好的矮牽牛植株。實(shí)驗(yàn)載體采用SAG12－IPT基因載體的質(zhì)粒，農(nóng)桿菌為EH105菌液?；九囵B(yǎng)基采用MS固體培養(yǎng)基:MS粉的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為4.4 g/L;蔗糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為30 g/L;瓊脂質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為7～8 g/L。

實(shí)驗(yàn)所用的PSAG12－ipt基因體系如圖1所示。

圖1 PSAG12－ipt基因體系

3 建立并優(yōu)化矮牽牛的轉(zhuǎn)化及再生體系實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)分為3組，將含有SAG12－IPT基因載體的質(zhì)粒(由美國(guó)威斯康星大學(xué)Amasino教授提供)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105和ABI菌株中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化矮牽牛幼葉，獲得轉(zhuǎn)化植株。由于該農(nóng)桿菌載體本身是抗利福平和慶大抗生素，搖菌時(shí)需要在培養(yǎng)基里加入利福平和慶大霉素。待轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)時(shí)，需用帶有頭孢霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行脫菌，把植物表面附著的菌殺死。最終要再用帶有慶大霉素的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化成功的外植體。

3.1 無(wú)菌受體材料的預(yù)處理

葉片或莖尖用洗衣粉進(jìn)行預(yù)處理20 min，再用蒸餾水沖冼1次，用70%乙醇(添加0.1%的吐溫20)洗30 s，0.1%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗多次。將無(wú)菌葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2～3 d，材料切口處剛剛開(kāi)始膨大時(shí)即可進(jìn)行侵染。

3.2 農(nóng)桿菌培養(yǎng)

①?gòu)钠桨迳咸羧尉洌臃N到20 mL附加相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上于27℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8。

②按1%～2%的比例，轉(zhuǎn)入新配制的無(wú)抗生素的細(xì)菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，可在以上相同的條件下培養(yǎng)6 h，當(dāng)OD600值為0.2～0.5時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化，同時(shí)加入100～500μmol的AS。

3.3 侵染

將菌液倒入無(wú)菌小培養(yǎng)皿中，可根據(jù)材料對(duì)菌液的敏感情況進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋。從培養(yǎng)瓶中取出預(yù)培養(yǎng)過(guò)的外植體，放入菌液中，浸泡1～5 min。取出外植體置于無(wú)菌濾紙上吸去附著的菌液。

3.4 共培養(yǎng)

將侵染過(guò)的外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上(MS十IAA 0.5 mg/L BA 2.0 mg/L)，在28℃暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2～4 d。

3.5 選擇培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有選擇壓(以NPT－Ⅱ?yàn)闃?biāo)記基因時(shí)一般使用卡那霉素)的脫菌(附加250～500 mg/L的羧芐青霉素或頭孢霉素，抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng))分化或愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照為2 000～10 000 lx、25℃條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。

3.6 繼代選擇培養(yǎng)與生根培養(yǎng)

選擇培養(yǎng)2～3周后，外植體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性不定芽或產(chǎn)生抗性愈傷組織，將這些抗性材料轉(zhuǎn)入附加選擇壓(適量慶大霉素)的生長(zhǎng)或分化培養(yǎng)基中令其生長(zhǎng)或誘導(dǎo)分化。待不定芽長(zhǎng)到1 cm以上時(shí)，切下并插入含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2周左右長(zhǎng)出不定根。

4 結(jié)果

將目的基因SAG－12成功轉(zhuǎn)入矮牽牛莖尖中3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，成功地得到了再生植株(見(jiàn)圖2)，并在經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)后成功誘導(dǎo)出根系，得到再生植株。

表1 不同時(shí)期的矮牽牛莖尖數(shù)量的統(tǒng)計(jì)

圖2 矮牽牛葉片轉(zhuǎn)化后的再生植株

5 討論

5.1 污染現(xiàn)象

該實(shí)驗(yàn)存在的染菌主要是真菌和細(xì)菌2類(lèi)。這類(lèi)污染通常是由環(huán)境不潔、培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料消毒不徹底、操作過(guò)程中操作人員或工具帶菌等引起［7－8］。細(xì)菌污染是指在培養(yǎng)過(guò)程中，在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體，以及菌落或渾濁的水跡狀，有時(shí)甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)膠狀的現(xiàn)象［9］。本次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的細(xì)菌污染主要是農(nóng)桿菌。推測(cè)染菌的主要原因是農(nóng)桿菌侵染后沒(méi)有用無(wú)菌水洗凈或者用濾紙吸干［10－11］。而真菌污染出現(xiàn)很快，一般接種后3～5 d就發(fā)現(xiàn)菌絲，繼而很快出現(xiàn)黑、白、黃、綠等孢子。本試驗(yàn)真菌污染主要由封口膜破損以及實(shí)驗(yàn)員操作引起。

對(duì)于污染現(xiàn)象，可采取以下措施:①由于葉片染菌現(xiàn)象嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)材料改用無(wú)菌莖尖代替葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)調(diào)整后效果比之前好［12］。②在操作過(guò)程中需要注意增強(qiáng)無(wú)菌意識(shí)。③在擴(kuò)大繁殖材料時(shí)應(yīng)嚴(yán)格檢查和挑選，疑是被污染的材料一律不再用于繁殖。要用無(wú)菌水多次沖洗實(shí)驗(yàn)材料，直到水不再渾濁。④每次超凈臺(tái)使用前都要用紫外線殺菌20 min以上，再用75%酒精噴霧降塵;組培用的鑷子和刀片都要徹底滅絕;雙手洗凈，每次出入超凈臺(tái)都必須用酒精噴霧殺菌。

5.2 褐化現(xiàn)象

褐化是指外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)過(guò)程中，由于切割造成機(jī)械損傷，傷口處分泌出酚類(lèi)化合物。在有氧的條件下，切面細(xì)胞中的酚類(lèi)物質(zhì)被多酚氧化酶催化，氧化為醌，醌再通過(guò)非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制細(xì)胞內(nèi)其他酶的活性，影響細(xì)胞的正常代謝，毒害整個(gè)組織，甚至導(dǎo)致組織死亡［13］。本實(shí)驗(yàn)矮牽牛外植體褐化現(xiàn)象非常嚴(yán)重。通常矮牽牛外植體培養(yǎng)不超過(guò)5 d即有部分會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

對(duì)于褐化現(xiàn)象，可采取以下措施:①配置培養(yǎng)基時(shí)可以加入PVP、AC等以防止褐化。②每一個(gè)平板封2個(gè)封口膜防止破損，如發(fā)現(xiàn)霉菌污染應(yīng)及時(shí)清除，并用加頭孢類(lèi)抗生素的無(wú)菌水沖洗數(shù)次。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Research of Transform SAG12－IPT Gene in Petunia Hybrida

WANG Li1，ZHANG Xiao－wei2
(1.Xinhui Institute of Forestry Science，Jiangmen 529100，China; 2.Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，China)

As the short florescence，the high cost of replacing flowers has always been the bottleneck of the art of cut－flowers.The aim of this empirical study is，taking Petunia hybrida Vilm.for example，to overcome the disadvantages of short florescence and short cutting period using transgenicmethod and to provide the theoretical support for the research and development of transgenic flowers.This research can get regenerative transgenic plants after antibiotics’screening by transforming SAG12－IPT gene，a gene which could prolong the senescence of plants，into Petunia.

petunia;leaf senescence;SAG12;tissue culture

Q37

A

1674－8425(2014)09－0062－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.09.014

2014－04－22

王立(1986—)，男，廣東人，碩士，工程師，主要從事生物工程研究。

王立，張曉薇.矮牽牛轉(zhuǎn)SAG12－IPT基因的研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014(9):62－65.

format:WANG Li，ZHANG Xiao－wei.Research of Transform SAG12－IPTGene in Petunia Hybrida［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(9):62－65.