范小斌 林秋雄 羅燕飛

·基礎(chǔ)研究·

Hsa-miR202通過下調(diào)IL-10的表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖

范小斌①林秋雄②羅燕飛①

目的：探討Hsa-miR202（人微小非編碼RNA-202）對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響及分子機制。方法：將Hsa-miR-202序列與ppG/miR/eGFP/Blasitidin質(zhì)粒定向連接，構(gòu)建靶向Hsa-miR-202基因的真核表達(dá)載體pmiR-202，運用脂質(zhì)體將pmiR-202轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，WST-8法檢測細(xì)胞增殖率，RT-PCR檢測IL-10、miR-202的相對表達(dá)水平，Western blot與ELISA檢測IL-10蛋白的表達(dá)水平，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體驗證miR-202與IL-10的相互結(jié)合作用。結(jié)果：經(jīng)DNA測序證實與設(shè)計完全一致，測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了miR-202的真核表達(dá)載體（pmiR-202），pmiR-202對A549細(xì)胞的增殖抑制率（24、48、72 h）分別為12%、38%、52%，并具有時間效應(yīng)關(guān)系，較空白對照組及陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pmiR-202后，miR-202的表達(dá)水平增加；過表達(dá)miR-202能下調(diào)IL-10基因及蛋白的相對表達(dá)水平，其相對水平分別為25%、0.75，IL-10活性的相對表達(dá)量為3.26±0.43 pg/mL，較空白對照組及陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）：熒光素酶活性結(jié)果顯示，克隆IL-10-3'UTR的質(zhì)粒與miR-202 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，引起熒光素活性的減低。結(jié)論：pmiR-202有效抑制A549細(xì)胞的增殖，并具有時間-效應(yīng)關(guān)系，其機制可能是miR-202通過靶向結(jié)合IL-10的3'UTR從而下調(diào)其在A549細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。

Hsa-miR202 IL-10 肺癌 A549細(xì)胞 增殖

MicroRNA miRNA是一類長21～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，通過與特定mRNA 3'UTR結(jié)合抑制蛋白質(zhì)表達(dá)參與生物的發(fā)育代謝及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生命現(xiàn)象［1］。miRNA在正常肺組織和肺癌組織、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、肺癌和其他實體腫瘤甚至于其他疾病中的表達(dá)模式不同。這種不同不但存在于實體腫瘤中，同時也存在于患者的血漿和血清中［2］。miR-202在肺癌細(xì)胞呈低表達(dá)，具有抑癌的作用［3］，因此運用過表達(dá)技術(shù)，探討miR-202對肺癌的生物作用，對指導(dǎo)臨床上肺癌的靶向基因治療具有潛在的意義。

白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是一種具有多向性生物活性的強免疫抑制因子，能通過自分泌或旁分泌的方式促進腫瘤生長，并能抑制細(xì)胞程序性死亡，調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境，影響腫瘤的轉(zhuǎn)移［4-5］。IL-10是肺癌細(xì)胞的自分泌因子，在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生并釋放至外周血中，具有診斷標(biāo)志物的應(yīng)用前景［6-7］。運用生物學(xué)軟件（TargetScan 6.2）預(yù)測到MiR-202的靶基因IL-10，生物學(xué)信息提示兩者之間存在可能相互調(diào)控關(guān)系，本研究旨在運用構(gòu)建miR-202真核表達(dá)載體質(zhì)粒，觀察其對肺癌A549細(xì)胞增殖作用及分子機制，為進一步揭示肺癌的發(fā)病機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；真核表達(dá)載體質(zhì)粒ppG/miR/eGFP/Blasitidin（上海吉瑪公司）；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶（日本TaKaRa公司）；瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國Omega公司）；CCK-8（Cell Count Kit-8）試劑（日本同仁化學(xué)研究所）；SYBR green試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；HEK293T、A549細(xì)胞株由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室惠贈；多克隆IL-10抗體、單克隆抗體GAPDH（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）Hsa-miR-202（5'-AGAG GUAUAGGGCAUGGGAA3'，MIMAT0002811）miRNA抑制劑（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/get_seq.pl？acc=MI zMAT0002811）；陰性對照序列與陰性對照抑制劑購自上海銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 Hsa-miR-202真核表達(dá)載體的構(gòu)建 Hsa-mi R-202表達(dá)載體模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTGGCCACTG ACT以避免形成終止信號，microRNA表達(dá)載體正義鏈模板的5'端添加了TGCT；反義鏈模板的5'端添加了GTCC。Hsa-miR-202（5'-AGAGGUAUAGGGCAUGGG AA-3'，MIMAT0002811），質(zhì)粒構(gòu)建與制備參照文獻(xiàn)［6］，質(zhì)粒的鑒定測序送上海吉瑪公司完成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱在培養(yǎng)，每3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，嚴(yán)格按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進行。實驗分為3組：空白對照組（不加轉(zhuǎn)染試劑），pmiR-202組（含有ppG/miR-202/eGFP/Blasitidin質(zhì)粒、LipofectamineTM2000），陰性對照組（negative group NC，含 LipofectamineTM2000、質(zhì)粒 ppG/miR/ eGFP/Blasitidin）。

1.2.3 WST-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 將1.0×105個/mL A549細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使pmiR-202終濃度分別為1.6 μg/mL，每組設(shè)5個復(fù)孔，非特異性對照組終濃度為1.6 μg/mL。置37℃、5% CO2培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度（A450/655 nm）值并計算各組增殖抑制率。公式：增殖抑制率（%）=（1-ApmiR-202組/A空白對照組）×100%。

1.2.4 構(gòu)建熒光素酶報告基因載體 運用生物學(xué)信息軟件預(yù)測miR-202靶基因為IL-10（http：//www.targetscan. org/cgi-bin/targetscan/vert_61/targetscan.cgi?species=Hu man&gid=&miR_c=miR-202-3p&miR_sc=&mir_nc=&mi rg=&sortType=&allTxs=&incl_nc=100）。提取A549細(xì)胞基因組DNA作為PCR擴增模板，調(diào)取IL-10全長的3'UTR序列，擴展引物分別添加XhoI和NotI酶切位點，XhoI和NotI雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，隨后將擴增片段連接至psiCHECK-2載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a大腸桿菌，酶切鑒定正確的陽性克隆送測序。將構(gòu)建好psiCHECK-2-IL-10-3'UTR與psiCHECK-2-IL-10-3'U TR-mut質(zhì)粒按照以下分組進行轉(zhuǎn)染：1）contrtol；2）miR-202 mimics（50 nmol/L）；3）negative control or NC group，50 nmol/L；4）NI group，100 nmol/L，miRNA inhibitor；5）NCI group，50 nmol/L，a negative control for N）。RNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物的配制嚴(yán)格按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進行共轉(zhuǎn)染HEK293T，最后雙熒光檢測。

1.2.5 RT-PCR檢測IL-10的表達(dá)水平 細(xì)胞分組同1.4，用Trizol法提取RNA，Premir-202轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后的48 h分別于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中GFP的表達(dá)；進而采取TRizol試劑提取RNA。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。作為PCR反應(yīng)的模版。miR-202 RT：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGTTCCCAT-3'）；miR-202F：5'-ACACTC CAGCTGGGAGAGGTATAGGGCATGG-3'；miR-202R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'）；擴增片段大小72 bp。GAPDH-F：5'GGATTTGGTCGTATTGGG-3'；GAPD H-R：5'GGAAGATGGTGATGGGATT-3'；U6-F：5'-CT CGCTTCGGCAGCACA-3'；U6-R：5'-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'；擴增片段大小94 bp。采用SYBRgreen摻入法進行熒光定量PCR反應(yīng)，95℃5 min預(yù)變性，95℃15 s，60℃15 s，72℃32 s，共40個循環(huán)，所有的樣本檢測均包含一個不加模板的陰性對照，以排除假陽性的結(jié)果。計算運用2-△△Ct值來比較對照組和實驗組的目的基因mRNA相對表達(dá)量的差異。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞IL-10的相對表達(dá)水平細(xì)胞分組同轉(zhuǎn)染同本文1.2.5，培養(yǎng)48 h，消化收集各組細(xì)胞。按細(xì)胞裂解液（RIPA）說明書提取細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果對各蛋白質(zhì)樣本進行校正。加入樣品溶解液和樣品，置沸水中煮5 min。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠），電壓80 V，進入分離膠后改為120 V，40 min。將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（NC）上，半干式轉(zhuǎn)膜15V，18 min；TBST洗膜5 min，5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。4℃過夜孵育一抗。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入電化學(xué)（electrochemiluminescence，ECL）試劑，顯影。BI-2000型圖像分析軟件分析IL-10和GAPDH的積分光密度，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.7 ELISA檢測IL-10蛋白的表達(dá)水平 將本文1.2.6中提取的蛋白50 μL加入到抗體包被板條的相應(yīng)孔中，37℃孵箱孵育90 min。洗板4次；加入生物素化抗體工作液，37℃孵箱孵育60 min。洗板4次，加入酶結(jié)合物工作液。37℃孵箱孵育30 min。洗板4次；加入顯色劑，避光37℃孵箱孵育10～15 min；加入終止液，混勻后即刻測量OD450值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析（one-way ANOVA）分析組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的測序鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pmiR-202的測序結(jié)果與設(shè)計的引物序列完全相符，所含目的基因序列準(zhǔn)確無誤，表明成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體（圖1）。

2.2 pmiR-202對A549細(xì)胞增殖的影響

采用1.6 μg/mL pmiR-202轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞作用24 h、48 h、72 h后，增殖抑制率分別為12%、38%、52%，具有時間效應(yīng)關(guān)系，較空白對照組及陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明過表達(dá)miR-202后，能有效抑制A549細(xì)胞的增殖（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒測序圖Figure 1 Diagrams of recombinant plasmid sequence

圖2 pmiR-202對A549細(xì)胞增殖抑制的影響Figure 2 Effects of pmiR-202 on proliferation inhibition of A549 cells

2.3 miR-202與IL-10 3'UTR相互結(jié)合作用

運用miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan（human 6.2版本）預(yù)測到miR-202 3'UTR序列139 bp和146 bp處有miR-202結(jié)合位點。將IL-10 3'UTR全長序列（1 033 bp）克隆到pisCHI-2載體上luciferase基因的下游，構(gòu)建psiCHECK-2-IL-10N-3'UTR載體，同miR-202 mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。進一步分別檢測突變結(jié)合位點1（505 bp）、結(jié)合位點2（869 bp）和同時突變兩個結(jié)合位點（505、869 bp）確證 miR-202與IL-103'UTR的直接結(jié)合作用。共轉(zhuǎn)染miR-202 mimics和psiCHECK-2-IL-10-3'UTR可以顯著減少luciferase的活性（P＜0.05），而突變結(jié)合位點1、2或同時突變兩個結(jié)合位點，lusiferase的活性幾乎不受影響，證明miR-202通過直接結(jié)合到IL-10 3'UTR上而發(fā)揮調(diào)控作用（圖3）。

圖3 熒光素酶活性的比較Figure 3 Comparison of luciferase activity

2.4 pmiR-202對miR-202、IL-10相對表達(dá)水平的影響

運用1.6 μg/mL的pmiR-202轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞作用48 h后，RT-PCR分別檢測miR-202、IL-10相對表達(dá)水平，過表達(dá)miR-202后，A549細(xì)胞內(nèi)miR-202表達(dá)水平明顯增加，其相對表達(dá)水平為145%，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明構(gòu)建的pmiR-202質(zhì)粒有效，實現(xiàn)了miR-202在A549細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)。過表達(dá)miR-202后，在A549細(xì)胞內(nèi)IL-10相對表達(dá)水平顯著下調(diào)，其相對表達(dá)水平為35%，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果說明miR-202通過直接結(jié)合到IL-10-3'UTR下調(diào)靶基因IL-10的表達(dá)水平（圖4）。

圖4 pmiR-202對miR-202、IL-10相對表達(dá)水平的影響Figure 4 Effects of pmiR-202 on the relative expression levels of miR-202 and IL-10

2.5 pmiR-202對IL-10蛋白相對表達(dá)水平的影響

用1.6 μg/mL的pmiR-202轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞作用48 h后，運用Western blot檢測IL-10蛋白的相對表達(dá)水平。過表達(dá)miR-202后，在A549細(xì)胞內(nèi)IL-10蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，其相對表達(dá)水平為0.75，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。運用ELASA方法檢測IL-10的相對活性，pmiR-202組IL-10的相對表達(dá)量為3.26±0.43 pg/mL，明顯低于空白對照組（18.79±0.36 pg/mL）與陰性對照組（17.2±1.2 pg/mL）。結(jié)果說明miR-202通過直接結(jié)合到IL-10-3'UTR下調(diào)靶基因IL-10的蛋白表達(dá)水平。

圖5 pmiR-202對IL-10蛋白相對表達(dá)水平的影響Figure 5 Effects of pmiR-202 on the relative protein expression levels of IL-10

3 討論

早發(fā)現(xiàn)、早診斷仍是肺癌治療的關(guān)鍵［8-9］。miRNA的表達(dá)具有時空特異性，在不同組織不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著性差異。這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時序性，miRNA的表達(dá)譜不僅指miRNA的種類，也指各種miRNA的豐度，直接反映了細(xì)胞組織的分化發(fā)育狀態(tài)。miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式，這為腫瘤的基因診斷提供了一種新方法［10］。

研究表明Hsa-miR-202在腫瘤的形成中具有促癌與抑癌的作用。石棉作業(yè)的肺癌患者的肺癌組織miR-202呈低表達(dá)，可能抑制肺癌的發(fā)生與發(fā)展［11］。Yu等［12］利用RT-PCR分析112例非小細(xì)胞肺癌患者組織miR-202/let-7、miR-137miR-182和miR-372的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)可以利用這些microRNA的綜合表達(dá)情況來對患者進行診斷。因此，本研究選取在肺癌中具有抑癌作用的Hsa-miR-202，構(gòu)建其真核表達(dá)載體質(zhì)粒，運用質(zhì)脂體2000轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，實現(xiàn)其在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，充分發(fā)揮其抑癌作用。DNA測序證實與設(shè)計完全一致，測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了miR-202的真核表達(dá)載體（pmiR-202），pmiR-202對A549細(xì)胞的增殖抑制率（24、48、72 h）分別為12%、38%、52%，具有時間效應(yīng)關(guān)系。

支氣管肺癌的組織勻漿中IL-10水平升高，免疫組化證實IL-10源于腫瘤細(xì)胞。肺癌患者的TNM分期越晚，CD4+CD25+T和IL-10的表達(dá)水平越高［13］。CD4+CD25+T和IL-10水平隨著腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移程度的增加而升高，從而進一步改變宿主對腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫殺傷［4，7］。本研究而轉(zhuǎn)染pmiR-202后，能下調(diào)IL-10的相對表達(dá)水平空白對照組miR-202呈高達(dá)，研究結(jié)果證實了以上報道。miR-202調(diào)控NMYC的表達(dá)，并且能夠抑制高擴增NYMC神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖［14-15］。為了進一步探討miR-202與IL-10相互調(diào)控關(guān)系，運用生物學(xué)信息軟件（Target Scan 6.2）預(yù)測到MiR-202的靶基因為IL-10，將克隆IL-10-3'UTR的質(zhì)粒與miR-202 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，引起熒光素活性的減低。結(jié)果表明miR-202與IL-10存在相互調(diào)控關(guān)系。同時，miR-202通過直接結(jié)合到IL-10-3'UTR下調(diào)靶基因IL-10基因與蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，pmiR-202有效抑制A549細(xì)胞的增殖，并具有時間-效應(yīng)關(guān)系，其機制可能是miR-202通過靶向結(jié)合IL-10的3'UTR，從而下調(diào)其在A549細(xì)胞的表達(dá)。但是本研究僅運用了一株細(xì)胞株作為研究對象，存在一定的缺陷，今后將研究miR-202用動物實體瘤的生物學(xué)作用，為更深層次揭示miR-202在肺癌的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

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15 Hung JJ,Jeng WJ,Hsu WH,et al.Predictors of death,local recurrence,and distant metastasis in completely resected pathological stage-I non-small-cell lung cancer[J].J Thorac Oncol,2012,7(7)：1115-1123.

（2014-05-05收稿）

（2014-10-20修回）

（本文編輯：楊紅欣）

范小斌 專業(yè)方向為腫瘤臨床檢驗。

E-mail：fanxiaobinvip@163.com

Hsa-mir-202 inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells by reducing expression of IL-10

Xiaobin FAN1,Qiuxiong LIN2,Yanfei LOU1

1Department of Clinical Laboratory,2Medical Research Centre,Guangdong Provincial Academy of Medical Science and the People's Hospital of Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

Objective:To study the effects of the overexpression of hsa-miR-202 on the proliferation and molecular mechanism of lung cancer A549 cells.Methods:A sequence of hsa-miR-202 with ppG/miR/eGFP/Blasitidin pasmid was directionally connected and a eukaryotic expression vector pmiR-202 of the target hsa-miR-202 gene was constructed.pmiR-202 was transtected to A549 cell with Lipofectamine 2000.The WST assay was used to detect the cell proliferation rate,and RT-PCR was used to detect the relative gene expression levels.Western blot analysis was used to detect the IL-10 protein expression levels.The interaction between miR-202 and IL-10 was examined using a luciferase reporter assay.Results:The design from the DNA sequencing results shows that a eukaryotic expression vector of miR-202 was successfully constructed.The proliferation inhibition rates of A549 cells by Pmir-202 were 12%, 38%,and 52%.The differences in the treatment group compared with the blank control and negative control groups were statistically significant.The RT-PCR results showed that the relative expression levels of miR-202 increased after transfection with pmiR-202.Overexpression of miR-202 can downregulate the relative gene and protein expression levels of IL-10,and the relative levels were 25%and 0.75,respectively.Compared with the blank control and the negative control groups,the difference was statistically significant(P＜0.05).The fluorescent activity was reduced when transfection was performed with miR-202 mimics,and IL-10-3'UTR plasmid was cloned.Conclusion:pmiR-202 effectively inhibited the proliferation of A549 cells and exhibited a time-effect relationship with miR-202 by targeted combination with IL-10 3'UTR to downregulate IL-10 expression inA549 cells.

hsa-mir-202,IL-10,lung cancer,A549 cells,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.20140643