林金鑾 王發(fā)圣 葉君健 吳朝陽 李 祥 林建華

miR-17-92基因簇在骨肉瘤中的表達及其臨床意義*

林金鑾①王發(fā)圣①葉君?、賲浅枹倮?祥②林建華①

目的：探討人骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中miR-17-92基因簇的表達情況及其臨床意義。方法：運用Q-PCR法檢測63例骨肉瘤組織及鄰近部位正常骨組織中miR-17-92基因簇的表達水平，并分析miR-17-92基因簇表達與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：miR-17-92在所有組織中均有表達，且在腫瘤組織中表達明顯高于在正常組織中的表達（P＜0.05），另外，miR-17-92基因簇高表達患者預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027）。結(jié)論：miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中表達存在差異性，可能在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，有望成為骨肉瘤患者預(yù)后一種新的指標。

miR-17-92基因簇 骨肉瘤 預(yù)后

骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，進展迅速，預(yù)后差［1］。近年研究表明microRNA（miRNA）作為癌基因或抑癌基因廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，不同腫瘤組織miRNA表達譜不同，腫瘤組織中miRNA的表達可能成為新的腫瘤標志。其中，miR-17-92是一個典型的多順反子miRNA基因簇。在人類基因組中，miR-17-92位于染色體13q31.3上一個約長7kb的初級轉(zhuǎn)錄本C13orf25的第3個內(nèi)含子上。此編碼含有6個成熟的miRNA（miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1）［2］。大量研究表明，miR-17-92基因簇在多種實體瘤中表達明顯上調(diào)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3］。本研究采用Q-PCR方法檢測miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中的表達，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織來源及試劑材料

1.1.1 組織來源 收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科2007年1月至2013年9月經(jīng)手術(shù)切除或者活檢取得的63例骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織標本，所有標本均由本院病理科醫(yī)生確診為骨肉瘤。臨床病理信息由患者的病歷和病理報告獲得。其中男性33例，女性30例；年齡6～56歲，平均年齡17.08±13.12歲；Enneking外科分期：Ⅰ期8例，ⅡA期24例，ⅡB期26例，Ⅲ期5例；組織學(xué)類型：普通型（包括成骨細胞型、成軟骨細胞型、成纖維細胞型等）47例，小細胞型6例，毛細血管擴張型5例，其他類型（骨旁骨肉瘤、未分化型骨肉瘤）5例；骨肉瘤生長部位：股骨34例，脛骨19例，其他部位（包括肱骨等）10例。所有患者均獲隨訪，隨訪從開始手術(shù)至2014年3月，時間1～68個月，平均時間30.89+26.89個月。

1.1.2 主要儀器 LDZ5-2型常溫臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；Biofuge Stratos高速冷凍離心機（德國Heraeus公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱（常州國華電器公司）；Thermo Forme925型超低溫冰箱（美國Thermo公司）；PCR擴增儀（美國Beckman公司）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.1.3 主要試劑 Trizol裂解液（美國Invotrogen公司）；miRNA分離試劑盒（美國Invotrogen公司）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ABI公司）；miR-17-92基因簇引物序列F：5'-CTGTCGCCCAATCAAACTG-3'；R：5'-GTCACAATCCCCACCAAAC-3'）［4］，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及Q-PCR檢測 組織樣本在液氮中研碎，采用TaqMan miRNA Isolation Kit提取總RNA，應(yīng)用TaqMan microRNA assay和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：在20 μL反應(yīng)體系中進行逆轉(zhuǎn)錄；然后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋后，取稀釋的cDNA 2 μL與2 μL Taq-Man引物混合，在20 μL反應(yīng)體系中，95℃10 min變性，隨后95℃15 s，60℃60 s，40個循環(huán)。

1.2.2 miR-17-92基因簇表達量計算方法 實時熒光定量PCR采用相對定量法：miR-17-92基因簇表達以U6作為內(nèi)參照，空白對照為基準，待測樣品相對值=（2-△△Ct）的平均值±標準偏差，其中△Ct=（目的基因Ct-內(nèi)參Ct）的平均值±標準偏差；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct）的平均值±標準偏差。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料比較采用方差分析；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier生存分析，Log-Rank檢驗不同miR-17-92基因簇表達組間生存率的比較，用Cox模型對生存資料進行單因素及多因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織及相鄰正常骨組織中的表達

Q-PCR結(jié)果表明63例骨肉瘤組織miR-17-92基因簇表達相對值的平均值為8.36±1.36，其鄰近正常骨組織miR-17-92基因簇表達相對值的平均值為6.24±1.57，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1），且在63例骨肉瘤組織中有51例miR-17-92基因簇的表達高于相鄰正常骨組織的表達，提示miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織中表達可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

圖1 miR-17-92基因簇在63例骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中的表達Figure 1 miR-17-92 cluster expression in 63 pairs of osteosarcoma and adjacent normal bone tissues

2.2 miR-17-92基因簇與骨肉瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性

根據(jù)miR-17-92基因簇表達的平均值［5］，63例骨肉瘤患者分為低表達組25例，高表達組38例。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇的高表達與腫瘤進展及預(yù)后相關(guān)，而與患者的性別、腫瘤部位、年齡、病理類型、腫瘤大小、Enneking分期等因素?zé)o關(guān)（表1）。

2.3 Kaplan-Meier生存分析

25例miR-17-92基因簇低表達組骨肉瘤患者中有8例死亡，平均生存時間為8.12個月，5年生存率為68.0%；38例miR-17-92基因簇高表達組骨肉瘤患者中有23例死亡，平均生存時間為7.04個月，5年生存率為39.5%。從圖2中可以看出，miR-17-92基因簇高表達組骨肉瘤患者5年生存率及平均生存時間均低于低表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008，圖2）。

2.4 Cox回歸分析

對所有臨床病理指標進行單因素Cox回歸分析，取P＜0.05的因素再進行多因素回歸分析：單因素分析結(jié)果顯示骨肉瘤患者的miR-17-92基因簇高表達及進展對患者預(yù)后均有影響（P＜0.05），進一步行Cox多因素分析結(jié)果顯示miR-17-92基因簇高表達、進展均是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨立因素（P＜0.05，表2，3）。

表1 63例骨肉瘤患者miR-17-92基因簇的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Association between miR-17-92 cluster expression and the clinicopathological parameters in 63 osteosarcoma patients

圖2 骨肉瘤患者miR-17-92基因簇表達和生存時間之間的關(guān)系Figure 2 Correlation between miR-17-92 cluster expression and survival rates in 63 osteosarcoma patients

表2 miR-17-92基因簇及一般臨床病理因素在骨肉瘤患者預(yù)后中的單因素分析Table 2 Univariate analysis of the associations of prognosis with various clinicopathological parameters and miR-17-92 cluster expression in osteosarcoma

3 討論

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個核苷酸非編碼小分子RNA，雖然其只占人體基因數(shù)的2%，卻可以調(diào)控30%以上基因的表達［6］。miRNA主要是通過與下游靶基因mRNA 3'-UTR結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解以及抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯，調(diào)控靶基因的表達來發(fā)揮作用［7］。

表3 miR-17-92及一般臨床病理因素在骨肉瘤患者預(yù)后中的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of the associations of prognosis with various clinicopathological parameters and miR-17-92 cluster expression in osteosarcoma

已有文獻報道［8-12］miRNA在骨肉瘤組織中處于異常狀態(tài)，一部分miRNA被上調(diào)，另一部分miRNA被下調(diào)，這些miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或者抑癌基因的作用。近年來關(guān)于miR-17-92基因簇參與調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為的研究已越來越引起重視，一系列研究表明miR-17-92基因簇作為一個重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子廣泛地參與調(diào)控多種腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的基因，同時亦表明miR-17-92基因簇的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［13-14］，而對于miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織中的表達情況鮮見報道。

本實驗研究結(jié)果示miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織中的表達水平明顯高于鄰近正常骨組織中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時miR-17-92基因簇的高表達與腫瘤進展及預(yù)后相關(guān)，而與患者的性別、腫瘤部位、年齡、病理類型、腫瘤大小、Enneking分期等因素?zé)o關(guān)，這與其在食管癌、髓母細胞瘤等腫瘤中的研究結(jié)果一致［5，15-16］。進一步研究顯示高表達miR-17-92基因簇的骨肉瘤患者有著更差的預(yù)后，經(jīng)Cox多因素生存分析亦證明miR-17-92基因簇表達是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨立因素之一，說明miR-17-92基因簇是影響骨肉瘤臨床生物學(xué)行為的重要因素，對骨肉瘤病情進展及預(yù)后有影響，miR-17-92基因簇可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，表明miR-17-92基因簇也可以作為骨肉瘤患者的一個有效預(yù)后指標。但是本研究患者腫瘤標本例數(shù)有限，隨訪臨床資料的不全等因素，未能更詳盡分析其表達變化與術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、5年生存率等臨床因素之間的相關(guān)性，同時miR-17-92基因簇具體是何種編碼的miRNA在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，以及作用于哪些下游靶基因，均是需要進一步研究的內(nèi)容。

1 Weber KL.What's new in musculoskeletal oncology[J].J Bone Joint Surg Am,2005,87(6)：1400-1410.

2 Baumhoer D,Zillmer S,Unger K,et al.MicroRNA profiling with correlation to gene expression revealed the oncogenic miR-17-92 cluster to be up-regulated in osteosarcoma[J].Cancer Genet,2012, 205(5)：212-219.

3 Huang G,Nishimoto K,Zhou Z,et al.miR-20a encoded by the miR-17-92 cluster increases the metastatic potential of osteosarcoma cells by regulating Fas expression[J].Cancer Res,2012,72(4)：908-916.

4 Dews M,Homayouni A,Yu D,et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster[J].Nat Genet,2006, 38：1060-1065.

5 Liu M,Wang Z,Yang S,et al.TNF-alpha is a novel target of miR-19a[J].Int J Oncol,2011,38(4)：1013-1022.

6 Lim LP,L NC,Garrett-Engele P,et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs[J].Nature,2005,433(7027)：769-773.

7 Cho WC.OncomiRs：the discovery and progress of microRNAs in cancers[J].Mol Cancer,2007,6：60.

8 Wei RX,Cai L,Tan JH,et al.Differential expression of microRNA in osteosarcoma[J].Chinese Journal of Experimental Surgery, 2009,26(5)：636-637.[魏任雄,蔡 林,譚金海,等.骨肉瘤miRNA基因的差異性表達[J].中華實驗外科雜志,2009,26(5)：636-637.]

9 Lulla RR,Costa FF,Bischof JM,et al.Identification of Differentially Expressed MicroRNAs in Osteosarcoma[J].Sarcoma,2011,732690. 10 Wu ZY,Liu XY,Yang SH.MiR-21 affcets osteosarcoma cell proliferation[J].China oncology,2010,20(8)：561-565.[吳子晏,劉小云,楊述華.miR-21對骨肉瘤細胞增殖的影響[J].中國癌癥雜志,2010,20 (8)：561-565.]

11 He C,Xiong J,Xu X,et al.Functional elucidation of MiR-34 in osteosarcoma cells and primary samples[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(1)：35-40.

12 Zhang H,Cai X,Wang Y,et al.microRNA-143,down-regulated in osteosarcoma,promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity by targeting Bcl-2[J].Oncol Rep,2010,24(5)：1363-1369.

13 Xiang R,Lei H,Chen M,Li Q,et al.The miR-17-92 cluster regulates FOG-2 expression and inhibits proliferation of mouse embryonic cardiomyocytes[J].Braz J Med Biol Res,2012,45(2)：131-138.

14 Hong L,Lai M,Chen M,et al.The miR-17-92 cluster of microRNAs confers tumorigenicity by inhibiting oncogene-induced senescence[J].Cancer Res,2010,70(21)：8547-8557.

15 Murphy BL,Obad S,Bihannic L,et al.Silencing of the miR-17～92 cluster family inhibits medulloblastoma progression[J].Cancer Res. 2013,73(23)：7068-7078.

16 Attar M,Arefian E,Nabiuni M,et al.MicroRNA 17-92 expressed by a transposone-based vector changes expression level of cell-cycle-related genes[J].Cell Biol Int,2012,36(11)：1005-1012.

（2014-08-01收稿）

（2014-10-27修回）

（本文編輯：楊紅欣）

Expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma and its clinical significance

Jinluan LIN1,Fasheng WANG1,Junjian YE1,Zhaoyang WU1,Xiang LI2,Jianhua LIN1

1Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005;2Department of Orthopedics,Zhejiang Taizhou No.1 People's Hospital,Taizhou 318000,China

Jianhua LIN;E-mail:jianhual@126.com

Objective:To determine the expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissue samples and explore its association with clinical significance.Methods:Quantitative polymerase chain reactiom analysis was used to examine the expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissues.Normal bone tissues from 63 patients were matched,and the relationships between the expression of miR-17-92 cluster and the clinicopathological features and prognosis of osteosarcoma were explored.Results:The relative expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissues was significantly higher than those in adjacent normal tissues(P＜0.05).The high expression of miR-17-92 had a significant correlation with reduced survival(P=0.027).Conclusion:The expression of miR-17-92 cluster closely correlates with the occurrence and progress of osteosarcoma and may be used as an indicator for osteosarcoma prognosis.

miR-17-92 cluster,osteosarcoma,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20141243

①福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科（福州市350005）；②浙江省臺州市第一人民醫(yī)院骨科

*本文課題受福建省臨床重點?？平ㄔO(shè)項目和福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科（編號：XK201106）資助

林建華 jianhual@126.com

This work was supported by the Clinical Key Subject and Construction Project in Fujian Province and the Fujian Medical University Key Clinical Medical Disciplines(No.XK201106)

林金鑾 專業(yè)方向為骨腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：jinluanlin@163.com