石林春+姚輝+謝麗芳+朱英杰+宋經(jīng)元+張輝+陳士林

[摘要]課題組聯(lián)合相關(guān)研究者開(kāi)展動(dòng)物藥材DNA條形碼分子鑒定研究，并結(jié)合分析GenBank序列，采用BLAST分析防錯(cuò)、系統(tǒng)樹(shù)分析防錯(cuò)和Barcoding Gap檢驗(yàn)防錯(cuò)等方法核驗(yàn)序列的可靠性，構(gòu)建了中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。該庫(kù)由樣品數(shù)據(jù)庫(kù)、序列數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)組成，包含800余種動(dòng)物藥材和大量動(dòng)物藥材混偽品及密切相關(guān)物種。中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)可以通過(guò)中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（www.tcmbarcode.cn）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)訪問(wèn)并實(shí)現(xiàn)未知?jiǎng)游飿颖镜腄NA條形碼鑒定。該研究首次構(gòu)建統(tǒng)一的中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)動(dòng)物藥材鑒定、資源可持續(xù)利用和瀕危物種保護(hù)均有重要意義。

[關(guān)鍵詞]動(dòng)物藥材；數(shù)據(jù)庫(kù)；COI；鑒定

DNA條形碼技術(shù)是動(dòng)物藥材鑒定的新工具^[1]，國(guó)家藥典委員會(huì)已討論通過(guò)在《中國(guó)藥典》增補(bǔ)本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則^[2]。本課題組聯(lián)合相關(guān)研究者開(kāi)展了大量的動(dòng)物藥材DNA條形碼分子鑒定研究工作。鄢丹等對(duì)包含羚羊角、鹿角的傳統(tǒng)角類(lèi)藥材進(jìn)行DNA條形碼研究^[3]，并以此為基礎(chǔ)提出了瀕危動(dòng)物藥材的貿(mào)易監(jiān)控和替代品尋找策略^[4]。張輝等對(duì)《中國(guó)藥典》45種動(dòng)物藥材及其混偽品進(jìn)行DNA條形碼研究，結(jié)果表明45種動(dòng)物藥材的正品來(lái)源與其混偽品均可相互區(qū)分^[5]。崔麗娜等利用COI序列對(duì)金錢(qián)白花蛇及其常見(jiàn)混偽品進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，結(jié)果表明，金錢(qián)白花蛇COI序列可以明確地與混偽品區(qū)分開(kāi)^[6]。胡嶸等對(duì)海馬、海龍及其混偽品共14個(gè)種20份樣品的COI條形碼序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明運(yùn)用COI序列能夠準(zhǔn)確鑒定海馬、海龍的基原動(dòng)物及其混偽品^[7]。此外，還開(kāi)展了龜甲、鱉甲、鹿茸以及蛤殼等的DNA條形碼研究工作^[8-11]。動(dòng)物DNA條形碼分子鑒定研究工作的大量開(kāi)展，為構(gòu)建中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。

DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)不僅是存儲(chǔ)樣品信息和DNA條形碼序列的工具，而且是DNA條形碼研究和物種鑒定分析的生物信息學(xué)平臺(tái)，對(duì)推動(dòng)DNA條形碼研究發(fā)展具有重要意義^[12]。第一個(gè)國(guó)際DNA條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BOLD）由國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟（CBOL）于2007年建立^[13]。此外，國(guó)際上還有多個(gè)針對(duì)特定動(dòng)物類(lèi)群的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，如：Fish Barcode of Life Campaign （FISH-BOL，http：//www.fishbol.org/），Lepidoptera Barcode of Life（http：//lepbarcoding.org/），Mammalia Barcode of Life Campaign（http：//www.mammaliabol.org/）。此外，邵鵬柱等初步構(gòu)建了傳統(tǒng)藥物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//137.189.42.34/mherbsdb/），包含1 661個(gè)物種，36 679條序列^[14]。當(dāng)前，我國(guó)尚未構(gòu)建統(tǒng)一的動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，制約了DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物藥材鑒定、資源可持續(xù)利用和瀕危物種保護(hù)中的進(jìn)一步應(yīng)用。

1 材料

中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列來(lái)自于課題組聯(lián)合相關(guān)研究者所開(kāi)展的動(dòng)物藥材DNA條形碼分子鑒定研究及GenBank，包含800余種動(dòng)物藥材和大量動(dòng)物藥材混偽品及密切相關(guān)物種（表1）。

2 方法

對(duì)包含測(cè)序峰圖的樣品，根據(jù)Q值進(jìn)行單堿基和序列質(zhì)量檢測(cè)。對(duì)不包含測(cè)序峰圖的樣品，使用EMBOSS Transeq將核酸序列翻譯為蛋白序列，利用隱馬爾可夫模型（hidden Markov model，HMM）進(jìn)行COI條形碼區(qū)域核驗(yàn)^[13]。采用BLAST分析防錯(cuò)、系統(tǒng)樹(shù)分析防錯(cuò)和Barcoding Gap檢驗(yàn)防錯(cuò)等核驗(yàn)COI序列的可靠性^[2]，使用Muscle 3.8 進(jìn)行多序列比對(duì)^[15]，使用Paup 4.0進(jìn)行遺傳距離計(jì)算^[16]，使用MEGA 6.0構(gòu)建NJ（鄰接法）系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)^[17]。使用BLAST方法進(jìn)行物種鑒定分析，使用MySQL進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)管理，通過(guò)MySQLdb連接MySQL數(shù)據(jù)庫(kù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成 中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)由樣品數(shù)據(jù)庫(kù)、序列數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成。樣品數(shù)據(jù)庫(kù)包含完整的樣品采集和鑒定信息，即：樣品編號(hào)、分類(lèi)信息、憑證信息、采集者、采集地、鑒定者、1張到數(shù)張樣品及生境照片等。從GenBank中下載GB格式文件，利用BioPython進(jìn)行解析。僅保留物種分類(lèi)地位清晰，拉丁名不包含“sp.”，“spp.”等字符的Record。提取Record注釋中基因名稱(chēng)為“COI”或“CO₁”區(qū)域的序列，如Record來(lái)自于已發(fā)表的文獻(xiàn)，收集該文獻(xiàn)的PubMed ID、題目、作者、期刊、摘要等信息構(gòu)成文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)還包含本課題組聯(lián)合相關(guān)研究者所開(kāi)展的動(dòng)物藥材DNA條形碼分子鑒定研究文獻(xiàn)。中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)包含2010年版《中國(guó)藥典》^[18]和《中國(guó)藥用動(dòng)物志》（第2版）^[19]所載800余種動(dòng)物藥材和大量動(dòng)物藥材的混偽品和密切相關(guān)物種的COI序列。此外，中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)還包含樣品采集、樣品處理、DNA提取、PCR 擴(kuò)增、測(cè)序、序列拼接及結(jié)果判定等的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和技術(shù)流程（圖1）。

3.2 數(shù)據(jù)庫(kù)動(dòng)態(tài)管理 中國(guó)動(dòng)物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)每6個(gè)月更新1次。新增加樣品如包含測(cè)序峰圖，則依照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則去除測(cè)序峰圖兩端的低質(zhì)量區(qū)域^[2]，即：以20 bp的窗口分別從序列5′端和3′端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的Q值<20，則刪除1個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)1個(gè)堿基；如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目≤2，窗口停止滑動(dòng)。測(cè)序峰圖的剩余部分須≥300 bp，平均Q值≥30。拼接結(jié)果長(zhǎng)度須大于500 bp，Q值小于20的堿基數(shù)須≤1%，平均Q值須≥40。新增加樣品如不包含測(cè)序峰圖，使用EMBOSS Transeq將新增加COI序列翻譯為蛋白序列，使用隱馬爾可夫模型進(jìn)行COI條形碼區(qū)域核驗(yàn)，序列中COI條形碼區(qū)域的長(zhǎng)度須≥500 bp，且Ns≤1%。最后將序列與已有參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除可能的外源污染，例如螨蟲(chóng)、人等的COI序列。endprint