任建琳??呂祥??陳文婷??劉靜??侯風剛

[摘要] 目的 研究中藥健脾復方通過Wnt/β-catenin信號通路抑制裸鼠人大腸癌轉(zhuǎn)移的機制。 方法 建立人腸癌HT29細胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分為5組：模型組（生理鹽水組），健脾復方低、中、高劑量組[0.25，0.5，1mL/d]和5氟尿嘧啶組[1mg/（kg·2d）]。給藥第21天，各組均處死荷瘤鼠，測量腫瘤質(zhì)量。采用免疫組化法檢測各組瘤體的β-catenin表達。Elisa檢測裸鼠血清MMP-7表達。 結果 健脾復方低、中、高劑量組的瘤重抑制率分別為23.49%、45.64%、65.77%。免疫組化結果顯示，健脾復方能夠以劑量依賴性方式下調(diào)腫瘤組織β-catenin蛋白表達。Elisa結果顯示，健脾復方低、中、高劑量組裸鼠血清MMP-7表達量分別是模型組的0.84、0.62和0.45倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 結論 健脾復方能抑制人結腸癌裸鼠皮下移植瘤的轉(zhuǎn)移，其機制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)MMP-7表達有關。

[關鍵詞] 健脾復方；結腸癌；轉(zhuǎn)移；MMP-7；Wnt/β-catenin

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）04-23-04

Jianpi complex prescription inhibits colorectal cancer metastasis in nude mice through Wnt/β-catenin signal transduction pathway

REN Jianlin LV Xiang CHEN Wenting LIU Jing HOU Fenggang

Shanghai Municipal TCM Hospital Affiliated to Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai 200071，China

[Abstract] Objective To study effects of Jianpi Complex Prescription to hypodermatic transplanted tumor metastasis in colorectal cancer nude mice. Methods Colorectal cancer models in nude mice bear human HT-29 cells were established，and then were randomLy divided into 5 groups： Control group （NS control group），Jianpi Complex Prescription low-dose，mid-dose，high-dose group （0.25，0.5，1mL/d），5-FU group （1 mg/kg·2d）.All group of nude mice were sacrificed at the last time treatment for 21 days，the size and weight of tumor were measured.The β-catenin was tested by Immunohistochemistry； the MMP-7 expression in mice serum was assayed by ELISA. Results The inhibition rate of tumor in each group were respectively 23.49%，45.64%，65.77% in low，mid，and high-dose Jianpi Complex Prescription.Jianpi Jiedu Recipe dose-dependently reduced the level of β-catenin in mice tumor.The MMP-7 in low，mid，high-dose Jianpi Jiedu Recipe was obviously decreased compared with Control group（P<0.01）. Conclusion Jianpi Complex Prescription could inhibited the metastasis of colon carcinoma implant tumor of nude mice， which may be due to blocking Wnt/β-catenin signal pathway and reducing MMP-7 expression.

[Key Words] Jianpi compoiund recipe；Colorectal cancer；Metastasis；MMP-7；Wnt/β-catenin

大腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第3位[1-2]。目前大腸癌是以手術為主的綜合治療，中醫(yī)藥已成為結直腸癌綜合治療的重要方法[3-4]。我們以往的臨床和實驗研究均表明健脾法在大腸癌治療中有著重要的地位。本研究是在前期研究發(fā)現(xiàn)健脾復方能夠抑制裸鼠人腸癌轉(zhuǎn)移

的基礎上[5-6]，進一步探討健脾復方通過Wnt/β-catenin信號通路抑制腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人結腸癌HT-29細胞系購自中科院上海細胞研究所。

1.2 動物

BALB/c裸小鼠，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2008-0016。endprint

1.3 藥物

健脾復方組成黃芪、黨參、炒白術、茯苓、炙甘草、半夏、虎杖、天龍、紅藤、藤梨根、生牡蠣，每毫升含生藥3g，由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備[5]；5氟尿嘧啶（5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號20100910）；兔抗人β-catenin單克隆抗體（美國CST公司）；MMP-7 ELISA試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱（GalaxyS，英國RS Biotech公司）；熒光倒置顯微鏡（CKX41/U-RFLT50，日本OLYMPUS公司）；高速冷凍離心機（5804R，德國Eppendorf公司）；切片機（RM2145，德國Leico公司）。

1.5 方法

1.5.1 人腸癌細胞培養(yǎng) 人結腸癌HT-29細胞，用含10%的胎牛血清、1.5g/L碳酸氫鈉、1.5mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.2 裸鼠人腸癌皮下移植瘤模型的建立及分組給藥 按照文獻中報道的方法建立人腸癌HT-29細胞皮下移植瘤模型[7]。待腫瘤生長至100～300mm3，將動物隨機分為5組，每組10只：（1） 模型組（生理鹽水組）；（2） 健脾復方（0.25mL/d）；（3）健脾復方（0.5mL/d）；（4）健脾復方（1mL/d）；（5）5-FU[1mg/（kg·2d）]。健脾復方每天灌胃給藥，5-FU隔天腹腔注射給藥，模型組每天灌胃等量的生理鹽水。給藥第21天摘除眼球取血，處死小鼠，并取出瘤體，測量瘤體質(zhì)量。瘤重抑制率=（l-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%[8]。

1.6 免疫組化染色方法檢測β-catenin蛋白的表達

按照文獻中報道的方法[9]，將腫瘤組織以福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶（S-P）免疫組化染色法檢測腫瘤β-catenin蛋白的表達情況。每批染色均用已知的陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。在Olympus IX71顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，背景為藍紫色。隨機選10個高倍視野（×200），細胞數(shù)大于1000個以上，陽性計數(shù)采用雙盲法，以陽性率作為觀察指標。陽性表達率=表達陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7 ELISA法檢測裸鼠血清中MMP-7表達

將裸鼠進行摘除眼球取血，離心得到血清后進行ELISA實驗，測定血清中MMP-7的表達情況。實驗步驟按參照博谷公司提供的試劑盒說明書進行。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 健脾復方對裸鼠人腸癌的生長抑制作用

模型組、健脾復方低、中、高劑量組（0.25，0.5，1mL/d）和5-FU組瘤體質(zhì)量分別為（1.49±0.19）g、（1.14±0.21）g、（0.81±0.19）g、（0.51±0.18）g和（0.43±0.15）g。健脾復方低、中、高劑量組瘤重抑制率為23.49%、45.64%、65.77%。與模型組比較，健脾復方能夠明顯抑制腫瘤的生長，呈劑量依賴性（P<0.01）。健脾復方高劑量組與5-FU組比較腫瘤移植瘤無顯著性差異。說明健脾復方能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長。

2.2 健脾復方對裸鼠人腸癌β-catenin蛋白表達的影響

結果顯示，健脾復方低、中、高劑量均能夠顯著下調(diào)瘤體中β-catenin蛋白表達（P<0.01），分別是對照組的0.80、0.61和0.37倍，呈劑量依賴性（圖1）。說明，健脾復方能夠下調(diào)瘤體中β-catenin蛋白表達水平。

2.3 健脾復方對裸鼠人腸癌血清MMP-7表達的影響

Elisa結果顯示，健脾復方低、中、高劑量組均能下調(diào)裸鼠血清中MMP-7表達水平（P<0.01），分別是對照組的0.84、0.62和0.45倍，呈劑量依賴性（圖1）。這表明，健脾復方能夠抑制裸鼠人結腸癌MMP-7表達。

3 討論

大腸癌屬于中醫(yī)學“積聚”“腸風”等范疇，現(xiàn)代醫(yī)家參合前人認識和現(xiàn)代的臨床經(jīng)驗，認為素體正氣虧虛，加之平素飲食不節(jié)（潔），脾胃虧虛，濕熱毒、瘀毒郁積，最終形成大腸癌。病位在腸，病本在脾，以本虛標實為特點。本虛為脾虛，標實為濕熱瘀毒聚結。目前大腸癌的中醫(yī)辨證分型尚不統(tǒng)一，但綜合國內(nèi)的研究報道，脾虛是臨床上大腸癌的常見的中醫(yī)證型[10-11]。脾虛證貫穿于大腸癌的始終，并在大腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。因此，健脾法在大腸癌治療中有著重要的地位。

健脾復方以黃芪為君，合四君子湯健脾益氣，以資后天之本，脾氣得健，則氣生血運，正氣得復；佐以半夏、天龍、紅藤、藤梨根、生牡蠣等解毒散結之品，使腫塊得以徐徐消之，全方寓攻于補，攻補兼施，共奏扶正祛邪之功。健脾復方長期應用于大腸癌的治療，能夠明顯改善大腸癌患者臨床癥狀，減輕化療的不良反應，有效提高術后患者5年的生存率和降低1、2年轉(zhuǎn)移率[12-13]。實驗研究表明，健脾復方能夠抑制人大腸癌裸鼠移植瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腸癌的肝轉(zhuǎn)移[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾復方能夠以劑量依賴性方式抑制人腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。作為Wnt/β-catenin信號通路的核心基因，β-catenin降解復合體的異常（如APC或axin突變等）和β-catenin基因本身的突變均可致β-catenin降解障礙，在胞質(zhì)內(nèi)積累繼而進入細胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子Tcf-4/LEF，啟動靶基因VEGF、MMP-7等轉(zhuǎn)錄[17-19]，從而促進大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。為了研究健脾復方是否對腸癌Wnt/β-catenin信號通路有影響，我們采用免疫組化檢測該信號通過關鍵分子β-catenin蛋白表達情況，結果顯示，健脾復方能夠下調(diào)β-catenin表達水平，呈劑量依賴性。腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移過程中，細胞外基質(zhì)ECM的破壞是關鍵環(huán)節(jié)。在參與破壞ECM的酶類中MMPS是最重要的水解酶，尤其是MMP-7[19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，健脾復方能夠下調(diào)MMP-7表達。由于MMP-7是Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控的靶基因，因此我們推測健脾復方可能是通過Wnt/β-catenin信號通路抑制MMP-7表達來抑制腸癌的轉(zhuǎn)移。該研究結果與厚樸酚通過Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)MMP-7表達[20]，從而抑制人腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的觀點一致。endprint

綜上所述，健脾復方能夠抑制人腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而發(fā)揮作用，詳細機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2013-11-24）endprint